月季不同部位总黄酮含量分析及其抗氧化活性研究

钱慧琴，秦晶晶，赵媛，王莹，张学敏，闫福林，3，*

（1.新乡医学院三全学院，河南新乡453000；2.宜阳县人民医院，河南洛阳471000；3.新乡医学院，河南新乡453000）

月季（Rosa chinensis Jacq.）为蔷薇科蔷薇属常绿灌木，在我国大部分地区均有栽培，可供观赏、食用和药用[1]。入药部位是花，传统功效是活血调经，疏肝解郁，主要用于治疗气滞血瘀、月经不调、痛经、闭经、胸肋胀痛[2]。月季果实未被充分利用而被丢弃，造成资源的浪费。现代研究表明，月季中主含黄酮类、酚酸类、芳香油类和色素类等[3-9]。其中黄酮类成分在抗氧化[6-8]、抗真菌[9-10]、抗肿瘤[11]、抗衰老[12]等方面具有良好的生物活性，具有广泛的开发前景。对于月季花、叶、果实总黄酮含量测定方法已有报道，但涉及月季花、叶、果总黄酮含量的比较还未见报道，本次试验旨在探讨月季不同部位总黄酮的含量，并采用DPPH法评价月季叶中总黄酮抗氧化活性，为进一步开发植物资源提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HA2004电子分析天平：上海象平仪器仪表有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；R206型旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；101-8型电热鼓风恒温干燥箱：江苏金坛市佳美仪器有限公司。

1.2 材料

样地设在新乡医学院三全学院，于2017年9月，在样地中选取5株生长正常的月季植株，分别剪下叶、花、果实，用湿布包裹，塑料袋封装，立即带回实验室。将材料洗净，用滤纸吸干，其中，果实去除种子，于80℃烘干，粉碎，过筛，将烘干样品放入广口瓶，置于-20℃冰箱保存，备用。芦丁对照品：购自中国食品药品检定研究院（批号：100080-201408）；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：购自东京化成工业株式会社（CAS：1898-66-4）；95%乙醇、NaNO2等试剂均为分析纯，购于天津市德恩化学试剂有限公司。

2 试验方法

2.1 月季花、叶、果实中总黄酮含量的测定

2.1.1 芦丁对照品溶液的制备

取芦丁对照品25.0 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加乙醇少量使其溶解，然后用乙醇定容至刻度。从母液中精密量取10.00mL，置于50mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀即得芦丁对照品溶液（0.1 mg/mL）。

2.1.2 供试品溶液的制备

取叶、花、果实粗粉约1 g，各取3份，精密称定，倒入250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL 95%乙醇，分别加热（60℃）回流提取3次，过滤，合并滤液，于50℃减压浓缩至干，加水50 mL悬浮，加石油醚洗涤3次，弃去石油醚部分，水相再加乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩至无乙酸乙酯味，加少量乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，即得供试品溶液，备用。

2.1.3 芦丁标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品溶液 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%硝酸钠，摇匀后放置6 min，加入0.4 mL 10%硝酸铝，放置6 min，再加入4 mL 4%NaOH溶液，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，用紫外-可见分光光度计上测定不同浓度芦丁对照品溶液在510 nm处的吸光度A510。以芦丁浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，进行回归分析，并计算相关系数R2。

2.1.4 精密度试验

精密量取6份对照品溶液2 mL，按照“2.1.3”项下方法，在510 nm波长处分别测定吸光度A，计算RSD值。

2.1.5 稳定性试验

精密量取“2.1.2”项下月季叶的供试品溶液和“2.1.1”项下的芦丁对照品溶液各1 mL，于室温条件下放置 0、2、4、6、8、10 h，按照“2.1.3”项下方法，分别测定各个时间点的吸光度A，计算RSD值。

2.1.6 重复性试验

分别精密吸取6份“2.1.2”项下月季叶的供试品溶液1 mL，按照“2.1.3”项下方法，测定吸光度A，计算RSD值。

2.1.7 加样回收率试验

分别取“2.1.2”项下已知总黄酮含量（21.73 mg/g）的月季叶供试品溶液6份，约10.87 mg，精密称定，按1∶1（质量比）比例加入对照品，按照“2.1.3”项下方法，测定吸光度A，计算回收率和RSD值。

2.1.8 供试品中总黄酮含量测定

精密吸取月季花、果实、叶片供试品溶液3.00、3.00、1.00 mL，置于 10 mL 容量瓶中，按“2.1.3”项下方法测吸光度。代入回归方程得试验结果。

2.2 月季总黄酮抗氧化活性测定

2.2.1 供试品溶液制备

以“2.1.2”项下方法制备月季叶的样品液作为母液，从母液量取适量溶液置25 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别制成质量浓度为4、8、12、16、20、24、32、36、40 μg/mL（以总黄酮含量计）的供试品溶液，备用。

2.2.2 DPPH样品溶液配制

精确称取13.0 mg的DPPH（分子量：394）到50 mL的容量瓶中，无水乙醇定容，配制成6.5×10-4mol/L的储备溶液，取出10 mL的储备液，置于50 mL容量瓶中，无水乙醇溶液稀释至刻度，制得浓度为1.3×10－5mol/L的DPPH溶液，备用。

2.2.3 维生素C样品溶液的配制

维生素 C（分子量：176）10.0 mg，精确称定，置于100 mL的容量瓶中，用少量无水乙醇溶解，然后用无水乙醇稀释至刻度，配制成维生素C浓度为0.57 mmol/L的储备液。分别取出 1、2、3、4、5、6、8、9、10 mL 的维生素C储备液分别于25 mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，配制成 4、8、12、16、20、24、32、36、40 μg/mL 维生素C的一系列溶液。

2.2.4 月季叶中总黄酮对DPPH自由基清除活性的测定

在10 mL试管中分别加入2 mL的1.3×10－5mol/L DPPH溶液和2 mL的不同浓度的各样品溶液，密封，避光反应30 min，于517 nm处测定各样品溶液的吸光度为A1，同时以等量乙醇溶液作为空白对照，并且平行测定用乙醇溶液作参比时的吸光度A2（即为2 mL的1.3×10－5mol/L DPPH溶液加入2 mL的无水乙醇溶液），测定2 mL的无水乙醇溶液和2 mL不同浓度的各样品液混合液的吸光度为A0。根据下面的公式计算清除率及EC50。

式中：A2为2 mLDPPH中加入2 mL的无水乙醇的吸光度；A1为2 mLDPPH中加入2 mL各样品溶液的吸光度；A0为2 mL无水乙醇中加入2 mL各样品液的吸光度。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

以芦丁浓度为横坐标，为A510为纵坐标，制定标准曲线（图1），得回归方程为：y=0.013x+0.017，相关系数R2=0.999 9。在 4.94 μg/mL～49.40 μg/mL 范围内有良好的线性关系。

图1 标准曲线Fig.1 The figure of standard curve

3.2 精密度试验

芦丁标准品溶液精密度试验结果见表1，计算RSD为0.38%（n=6），表明该试验精密度良好。

表1 精密度试验（n=6）Table 1 The results of precision test（n=6）

3.3 稳定性试验

月季叶供试品溶液和芦丁标准品溶液稳定性试验结果见表2，计算RSD为0.50%和0.51%（n=6），表明样品和芦丁对照品溶液在10 h内稳定。

表2 稳定性试验结果（n=6）Table 2 The results of stability test（n=6）

3.4 重复性试验

月季叶供试品溶液稳定性试验结果见表3，计算RSD为0.27%（n=6），表明该试验重复性良好。

表3 重复性试验结果（n=6）Table 3 The results of repeatability test（n=6）

3.5 加样回收率试验

月季叶的供试品溶液加样回收率试验结果见表4，计算平均加样回收率为99.09%，RSD为0.53%（n=6），表明该试验加样回收率良好。

3.6 月季不同部位总黄酮含量测定

月季花、果、叶中总黄酮含量分别（12.01±0.09）mg/g，（n=6）、（5.16±0.12）mg/g （n=6）、（21.73±0.16）mg/g，（n=6）。月季叶中总黄酮含量明显高于花和果。总黄酮含量测定结果见表5。

表4 加样回收率试验结果（n=6）Table 4 The results of recovery test（n=6）

表5 月季不同部位总黄酮的含量测定结果Table 5 Content distribution of total flavonoids in different parts of Rosa chinensis Jacq.

3.7 DPPH自由基清除作用的测定

不同浓度的月季叶的总黄酮溶液、对照品VC溶液对DPPH自由基清除率结果见图2。

图2 月季叶的总黄酮和VC对DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on DPPH radical

在浓度 1 μg/mL～24 μg/mL 范围内其清除能力随总黄酮浓度的升高而加强，而浓度增加为36 μg/mL，清除率增加不明显，并趋于平衡。根据SPSS22.0软件数据分析，得到月季总黄酮EC50为1.023 μg/mL和VC的EC50为11.297 μg/mL，可见，月季总黄酮对DPPH清除率明显高于VC。

4 讨论与结论

1）目前尚未见到比较月季花、叶和果实的总黄酮含量的的相关报道，因此，本试验以芦丁为对照品，硝酸钠、硝酸铝及氢氧化钠为显色剂，采用紫外分光光度法测定月季不同部位总黄酮的含量。通过方法学考察，结果表明，该方法用于测定月季花、叶、果实总黄酮含量，精密度、重现性和稳定性均符合含量测定要求，操作简便，结果可靠，为今后月季总黄酮含量的检测提供便捷的方法。

2）月季资源丰富，全国各地都有栽培，月季花利用率较高，但是其叶、果利用率很低，造成资源的浪费。本次试验通过测定月季不同部位总黄酮含量可知，叶中总黄酮含量最高，其次是花和果实；叶中总黄酮含量为21.73 mg/g，且月季叶中总黄酮对于DPPH的清除能力明显高于VC，可以开发成天然抗氧化剂，具有潜在的研究和开发价值。