张小华,操庆国,郭钦
(1.江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院,江苏镇江212400;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013)
面制品是一种有着悠久历史的传统食品,制作的工艺多,产品种类也较多。在面制品制作为成品的同时,腐败变质问题一直困扰左右,而腐败变质问题主要由微生物引起的[1]。直至防腐剂的出现,一定程度上解决了面制品腐败的问题,延长了贮藏时间。一般添加到食品的防腐剂种类很多,偶尔食用问题不大,但是长期食用也会在体内富集从而影响人体健康[2],特别是人们日常生活中食用量较大的面制品,因此国标GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》也对面制品中防腐剂使用量有明确限制[3]。
随着现代人们生活水平的提高,对食品安全的标准和要求也在提高,发现并使用更安全更高效的防腐剂一直在不断的研究中。新型的食用防腐剂一般分为化学制剂的和生物制剂两大类,化学类的有丙酸钙、对羟基苯甲酸丙酯、乳酸钠和富马酸等[4-8],生物类的有聚赖氨酸、纳他霉素和乳酸链球菌素等[9-13]。本试验从腐败的面制品中分离出5种共11株霉菌[14-16](包括2株青霉菌、2株黄曲霉菌、3株丝孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌),针对这些不同菌种以及同种不同株之间的差异,研究以上几种新型防腐剂对其抑菌效果,旨在为面制品新型防腐技术的使用提供参考。
富马酸、乳酸钠、丙酸钙、对羟基苯甲酸丙酯、纳他霉素、聚赖氨酸、乳酸链球菌素:中国国家标准物质研究中心。2株青霉菌、2株黄曲霉菌、3株丝孢酵母菌、1株黑根霉菌、3株黑曲霉菌:分离自不同来源腐败变质的面制品。控温摇床培养箱(AG3000):无锡市AIBOER科技技有限公司;台式培养箱(RT151):杭州长城仪器设备有限公司。
1.2.1 培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基的配制:按照培养基所要求的比例,加热沸腾至完全溶解,分装后高压灭菌备用。
察氏液体培养基的配制:参照GB4789.28-84《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》进行配制[17]。
1.2.2 菌悬液的制备
将5种共11株霉菌32℃条件下分别在PDA斜面培养基上活化24 h,之后霉菌菌种再分别接种于察氏液体培养基中,在28℃下震荡培养36 h,菌液的浓度约为107CFU/mL。
1.2.3 抑菌活性的测定
以培养好的察氏液体培养基为基质,分别添加含不同浓度防腐剂作为试验对照组,阳性对照组用无菌水取代防腐剂[18-22]。混合定容后将培养液各取0.1 mL涂平板,32℃条件下培养24 h,计数并以此计算各种防腐剂的抑菌率。
1.2.4 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定
根据不同浓度防腐剂对霉菌的抑菌效果,初步确定MIC的范围。再在此范围内配制不同浓度的防腐剂溶液测定其抑菌率,抑菌率为100%的浓度即为最低抑菌浓度[23-24]。
分别配制0.1、1.0、10 mg/mL等3个梯度浓度的富马酸、乳酸钠、纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸和丙酸钙溶液添加到培养好的察氏液体培养基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培养后计算抑菌率,考察对青霉菌、黄曲霉菌、丝孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌效果,同种不同株之间的抑菌效果以平均抑菌效果计,结果见图1~图3。
图1 浓度为0.1 mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of mould
图2 浓度为1 mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of mould
图3 浓度为10 mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of mould
由图1~图3可知,纳他霉素和聚赖氨酸对青霉菌、黄曲霉菌、丝孢酵母菌和黑根霉菌抑菌效果较好,0.1 mg/mL的纳他霉素和聚赖氨酸基本能达到对4种霉菌100%的抑菌效果,但是对黑曲霉菌的抑菌效果不明显,10 mg/mL的纳他霉素才能达到75%的抑菌效果,以及10 mg/mL的聚赖氨酸才能达到98%的抑菌效果;而1 mg/mL的乳酸链球菌素对5种霉菌能达到100%的抑菌率;富马酸的整体的抑菌效果最不理想,0.1 mg/mL浓度对丝孢酵母菌、黑根霉菌和黑曲霉菌的抑菌率为0,10 mg/mL浓度也只能对丝孢酵母菌达到100%的抑菌率。
2.2.1 青霉菌株之间抑菌效果的比较
分别配制浓度为0.1 mg/mL的富马酸、乳酸钠、纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸和丙酸钙溶液添加到培养好的察氏液体培养基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培养后计算抑菌率,考察对青霉菌不同菌株之间的抑菌效果,结果见图4。
由图4可知,0.1 mg/mL浓度的纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸溶液对青霉菌株的抑菌效果较好,基本能达到100%,且对青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果差异不大;乳酸钠对青霉菌1和青霉菌2的抑菌效果有差异,两者之间相差达到30%;富马酸对青霉菌的抑菌效果最差,抑菌效果只能达到20%。
2.2.2 黄曲霉菌株之间抑菌效果的比较
分别配制浓度为0.1 mg/mL的富马酸、乳酸钠、纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸和丙酸钙溶液添加到培养好的察氏液体培养基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培养后计算抑菌率,考察对黄曲霉菌不同菌株之间的抑菌效果,结果见图5。
由图5可知,0.1 mg/mL浓度的纳他霉素、乳酸链球菌素、聚赖氨酸溶液对2种黄曲霉菌株的抑菌效果都很好,抑菌率能达到100%;对羟基苯甲酸丙酯对黄曲霉菌1和黄曲霉菌2的抑菌效果有明显差异,两者之间相差达到90%;富马酸和乳酸钠对黄曲霉菌株的抑菌效果最差,且菌株之间的抑菌效果差不多。
图4 浓度为0.1 mg/mL的防腐剂对不同株青霉菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of 0.1 mg/mL preservative on different strains of Penicillium
图5 浓度为0.1 mg/mL的防腐剂对不同株黄曲霉菌的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus flavus
2.2.3 丝孢酵母菌株之间抑菌效果的比较
分别配制浓度为0.1 mg/mL的富马酸、乳酸钠、纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸和丙酸钙溶液添加到培养好的察氏液体培养基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培养后计算抑菌率,考察对丝孢酵母菌3种不同菌株之间的抑菌效果,结果见图6。
图6 浓度为0.1 mg/mL的防腐剂对不同株丝孢酵母菌的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of trichosporon
由图6可知,0.1 mg/mL浓度的纳他霉素和聚赖氨酸对3种丝孢酵母菌株的抑菌效果都较好,抑菌率都能达到95%以上;而乳酸钠、对羟基苯甲酸丙酯和丙酸钙对3种丝孢酵母菌株的抑菌效果存在明显差异;富马酸对3种丝孢酵母菌株的抑菌效果不佳,且不同菌株之间的抑菌率差异明显。
2.2.4 黑曲霉菌株之间抑菌效果的比较
分别配制浓度为0.1 mg/mL的富马酸、乳酸钠、纳他霉素、乳酸链球菌素、对羟基苯甲酸丙酯、聚赖氨酸和丙酸钙溶液添加到培养好的察氏液体培养基中,混合定容后取0.1 mL涂平板培养后计算抑菌率,考察对黑曲霉菌3种不同株之间的抑菌效果,结果见图7。
图7 浓度为0.1 mg/mL的防腐剂对不同株黑曲霉菌的抑菌效果Fig.7 Bacteriostatic effect of preservatives of 0.1 mg/mL on different strains of Aspergillus niger
由图7可知,只有对羟基苯甲酸丙酯对黑曲霉菌3的抑菌率达到100%;纳他霉素、乳酸链球菌素、聚赖氨酸以及丙酸钙对3株黑曲霉菌的抑菌率效果差异较大;富马酸和乳酸钠基本对黑曲霉菌没有抑菌效果。
7种食品防腐剂最低抑菌浓度的分析见表1。
表1 7种食品防腐剂对霉菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of mould mg/mL
由表1可知,纳他霉素对11株霉菌都有很强的抑菌效果,在7种防腐剂中,它的最低抑菌浓度都是最小的;而富马酸对各株菌的最小抑菌浓度明显高于其他防腐剂,其抑菌效果在7种防腐剂中是最差的。
7种防腐剂最低抑菌浓度综合排序为:纳他霉素<乳酸链球菌素<聚赖氨酸<对羟基苯甲酸丙酯<丙酸钙<乳酸钠<富马酸。
本试验开展了7种新型食品防腐剂对面制品中腐败霉菌抑菌效果的比较研究试验。结果表明7种防腐剂对5种共11株霉菌都有不同程度的抑菌效果,含防腐剂溶液浓度越高其抑菌效果越好。总体来看,7种食品防腐剂抑菌效果强弱顺序为:纳他霉素>乳酸链球菌素>聚赖氨酸>对羟基苯甲酸丙酯>丙酸钙>乳酸钠>富马酸。同一种防腐剂对于同种不同株的霉菌,其抑菌效果也不尽相同,甚至相差很大。因此,对于防腐剂的抑菌效果,不能单纯以菌种来定论,应具体到所涉及的每一株菌[25]。从抑菌效果排序可以看出,前三名都是生物类防腐剂,试验也进一步证明了生物类防腐剂比化学类防腐剂更为高效、广谱,因此,天然、安全的生物类防腐剂将是未来食品防腐领域的重点。