儿童急性肾损伤相关新型生物标志物的研究进展

田晓怡， 沈 颖， 宋文琪

（1.国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院检验中心，北京 100045；2.国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院肾内科 儿童慢性肾脏病与血液净化北京市重点实验室，北京 100045）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）不是一种单一的疾病，是由多种病因引起的，以肾脏功能在短时间内急速下降为主要特征，并伴有一系列严重并发症的临床综合征。改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）采用血清肌酐（serum creatinine，SCr）和尿量定义AKI[1]。该诊断标准不仅适用于成人患者，也在大规模儿童患者队列中通过验证[2]。AKI是儿童住院患者，尤其是重症患儿常见的肾脏急重症。儿童AKI的发病率和死亡率都很高，已成为全球关注的公共卫生问题。最新的全球AKI荟萃分析显示，AKI的发病率在成人住院患者中高达21.6%，在儿童住院患者中高达33.7%，AKI相关的死亡率成人为23.9%，儿童为13.8%[3]。有研究结果显示我国住院患儿中AKI发生率约为0.3%，但漏诊率高达95.9%[4-5]。我国住院儿童实际的AKI发生率可能为18%左右[5]。

由于AKI病情进展迅速，死亡率高，即使存活下来的患儿大部分也可能进展为慢性肾脏疾病或需要肾脏替代治疗，而且目前AKI尚无特别有效的治疗方法，因此早期诊断和及时干预对于降低患儿死亡率，改善预后非常重要。传统的肾脏疾病标志物，如肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮等不能及时反映肾脏的损伤情况，但一些新的生物标志物有助于AKI的早期诊断，可以反映不同的病理生理学机制，或许能预测疾病进展，进而为改善AKI预后提供机会。为此，文章综述了一些重要的AKI新型生物标志物的生物学特征，及其用于国内外儿童AKI早期诊断、风险预测和预后判断的性能，并比较了其用于AKI成人和儿童患者诊断的差异，讨论了生物标志物在成人队列中的研究为何不能直接应用于儿童；同时，对这些标志物在儿童患者中的研究存在的局限和挑战作出分析。

1 传统的生物标志物SCr不能及时反映肾脏损伤情况

尽管目前仍根据SCr和尿量诊断AKI，然而这2项指标与肾脏的损伤进展并不平行。Cr主要用于评估肾小球滤过率，是反映肾脏功能的指标，但不是反映肾损伤的敏感指标，特别是在肾脏发生急性损伤的情况下，SCr不会立即升高。由于肾脏的储备能力很强，只有当肾功能损失50%时SCr才会出现明显的升高，这就可能造成诊断和治疗的延误，而且SCr受非肾性疾病因素如年龄、性别、饮食、肌肉含量与代谢、药物等的影响较多。因此，SCr诊断AKI的敏感性和特异性均不高，尤其对于儿童患者，不同年龄、体重者SCr基础值不一样，有些AKI患儿SCr峰值依然在参考区间内，这使得儿童患者比成人更易漏诊。

2 新的生物标志物辅助早期诊断AKI及风险预测

AKI理想的生物标志物是比SCr更早发生改变，能更早发现微小肾损伤，能够鉴定损伤发生部位，早期诊断AKI，辅助疾病分期，区分造成AKI的病因，能够评估预后以及监测治疗干预，可非侵袭性获得。近年来，新发现的生物标志物，如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）、肾损伤分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、肝型脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，L-FABP）、白细胞介素-18（interleukin 18，IL-18）、胰岛素样生长因子结合蛋白-7（insulinlike growth factor-binding protein 7，IGFBP7）以及金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）等均有较好的诊断敏感性和特异性，在AKI成人患者和儿童患者中均有较多报道。

2.1 NGAL

NGAL是一种相对分子质量为25 000的小分子蛋白，是脂质运载蛋白超家族中的一员，共价结合于中性粒细胞明胶酶[6]。正常情况下，血清NGAL水平非常低（约为20 ng/mL），主要是来自于中性粒细胞或肝、脾和肾的少量表达。当新生儿、儿童、成人发生缺血性肾损伤或肾毒性药物造成的肾损伤时，肾小管上皮细胞会大量表达NGAL并释放入血浆和尿中。

大量的临床研究结果显示，无论是成人还是儿童患者，血和尿NGAL是手术后或脓毒血症继发AKI的独立预测因素，是诊断AKI敏感且特异的早期生物标志物。HO等[7]对28项研究中尿和血浆生物标志物预测成人心脏手术相关AKI的临床效用进行系统综述和荟萃分析，发现术后24 h内检测尿NGAL的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的综合曲线下面积（area under curve，AUC）为0.72，血浆NGAL的综合AUC为0.71，表明尿和血浆NGAL对心脏手术相关AKI具有中等预测价值。儿童AKI患者中NGAL的诊断价值与成人接近甚至更好。PARIKH等[8]对311例先天性心脏病术后儿童进行前瞻性、多中心队列研究，发现尿NGAL与术后AKI的发生和较差的预后相关，对严重AKI具有中等诊断价值（AUC为0.71），而血浆NGAL与术后AKI无关。DONG等[9]追踪检测了150例行体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）术患儿尿液中6种生物标志物（NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP、TIMP-2、IGFBP7）术后2、6、12、24 h的水平，发现NGAL在CPB术后2 h即升高，6 h后其他5种标志物也升高，尿NGAL在每个时间点的诊断价值均最高（AUC＞0.9）。NGAL是目前被研究最多的AKI生物标志物。有研究结果显示，在SCr未发生明显变化前，AKI患儿的尿NGAL水平已升高，且在疾病进展过程中，与SCr呈正相关[10-12]；当尿NGAL的临界值为1.36 μg/mL时，其敏感性和特异性分别为83.6%和76.2%[12]；入院后2 h，血清NGAL对AKI的早期临床诊断也具有较好的参考价值（AUC为0.943）[10]。尿液NGAL可以用于早期预测脓毒血症患儿继发AKI，其AUC为0.82[13]。

2.2 KIM-1

KIM-1是相对分子质量为38 700的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含免疫球蛋白和黏蛋白结构域[6]，表达于肾近曲小管细胞。KIM-1最初是从缺血再灌注的大鼠肾脏细胞中发现的。正常人肾脏中KIM-1 mRNA的表达水平很低，在肾脏发生缺血损伤后急剧升高。KIM-1参与了肾损伤部位凋亡细胞、坏死细胞的清除，抑制促炎症因子的活化[14]。

KIM-1是AKI发生24 h内的早期生物标志物。与慢性肾脏疾病和急性肾衰竭（非缺血、非造影剂造成的急性肾衰竭）患者相比，急性肾小管坏死患者在缺血发生12 h后尿KIM-1水平显著升高[15]。SHAO等[16]对11项研究中的2 979例患者进行荟萃分析，发现尿KIM-1对婴儿和儿童AKI患者的诊断准确性比成人患者更好，他们推测这可能是由于高血压、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病在成人中患病率更高，而这些非肾性因素会影响尿KIM-1水平。因此，尿KIM-1用于诊断婴儿或儿童AKI比成人更可靠。最新的一些病例对照研究也与上述研究结论一致。XIE等[17]的研究结果显示尿KIM-1诊断成人AKI的AUC为0.69，敏感性为66.3%，特异性为64.7%，具有中度诊断价值。ASSADI等[18]的研究结果显示，尿液KIM-1诊断循环衰竭患儿AKI的效能优于IL-18和NGAL，KIM-1的AUC最高为0.81[95%可信区间（confidence interval，CI） 0.76～0.93，P＜0.001]。曹晓燕等[19]发现12 h内尿液KIM-1预测足月新生儿窒息后发生AKI的AUC为0.899，敏感性为86%，特异性为87%。

2.3 L-FABP

L-FABP是脂肪酸结合蛋白家族的一员，相对分子质量为14 000。L-FABP不仅表达于肝脏，也表达于小肠、胰腺、胃、肺和肾脏[6]。人肾脏L-FABP表达于近曲小管上皮细胞。L-FABP将游离脂肪酸转运入线粒体和过氧化物酶体代谢。当毒性过氧化物累积时，L-FABP能与其结合并外分泌入肾小管管腔内。

尿液L-FABP水平的升高早于SCr，可作为AKI的早期标志物。IVANIŠEVIC´等[20]检测了行CPB术患儿术前（0 h）及术后2、6、48 h的血清和尿液L-FABP水平，结果显示术后发生AKI的患儿尿液L-FABP水平明显高于未发生AKI的患儿（P＜0.05），且升高时间早于SCr，各个时间点尿液L-FABP的AUC均＞0.8，由此表明尿液L-FABP是早期诊断和预测AKI的有用的生物标志物。GREENBERG等[21]检测了408例行CPB术的患儿的尿液NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP、白蛋白和胱抑素C水平，结果显示L-FABP对CPB术后AKI的发生具有最好的预测价值，校正后的AUC为0.7。尿液L-FABP在我国儿童AKI早期诊断中的价值也有相关报道。唐荣等[22]以行CPB术的97例先天性心脏病患儿为研究对象，结果显示AKI组术后2和6 h尿液L-FABP和NGAL水平均显著高于非AKI组，其水平变化明显早于SCr的升高；尿液L-FABP在CPB术后2和6 h预测AKI发生的AUC分别为0.921和0.896，尿液NGAL的AUC分别为0.908和0.928。由此可见，尿液L-FABP和NGAL在儿童心脏术后AKI早期即显著升高，明显早于SCr的改变，可早期预测AKI的发生。尿液L-FABP对成人AKI患者具有中度诊断价值，但略低于儿童AKI患者。DOI等[23]的研究结果显示尿L-FABP早期诊断重症监护病房成人患者AKI的性能优于NGAL、IL-18、N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glycosaminidase，NAG）和白蛋白，其AUC为0.75。成人CPB术后检测尿L-FABP可以早期预测AKI，其AUC为0.69[24]。HO等[7]对6项关于L-FABP研究的1 700多例心脏手术后成人患者进行了荟萃分析，结果显示尿液L-FABP预测AKI的AUC范围为0.52～0.85，综合AUC为0.72，预测能力为中等。

2.4 IL-18

IL-18又称干扰素γ诱导因子，属于IL-1超家族，能够诱导T细胞和自然杀伤细胞产生干扰素γ，是一种促炎性细胞因子。IL-18的前体无活性，经半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1加工后变为有活性的细胞因子。AKI发生后IL-18在肾小管上皮细胞被诱导和激活，有活性的IL-18在肾小管上皮细胞高表达并释放入尿。

目前，关于IL-18能否早期预测AKI还有争议，在成人患者和儿童患者中结论不一致。HAASE等[25]的研究结果显示尿液IL-18并不能鉴别出发生AKI的患者。然而，患先天性心脏病的婴儿和儿童在CPB术后4 h尿液IL-18水平明显升高，其早期诊断AKI的AUC为0.855[26]。DONG等[9]研究了儿童患者CPB术后不同时间点尿液IL-18的水平，结果显示AKI组6 h后尿液IL-18水平开始升高，12 h达到峰值，其水平明显高于非AKI组；CPB术后6 h IL-18预测AKI的AUC接近0.8。LIN等[27]对11项研究的2 796例患者（儿童患者561例、成人患者2 235例）进行了系统综述和荟萃分析，结果显示尿液IL-18具有中度诊断价值，预测AKI 的比值比（odds ratio，OR）为5.11，敏感性为0.51，特异性为0.79，AUC为0.77；同时还发现尿IL-18对儿童患者AKI的诊断价值高于成人患者，其OR值为7.51。

2.5 IGFBP7和TIMP-2

IGFBP7是相对分子质量为29 000的分泌蛋白，能结合和抑制胰岛素生长因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）受体；TIMP-2是相对分子质量为21 000的小分子蛋白，属于金属蛋白酶组织抑制剂家族，可以抑制金属蛋白酶的活性。IGFBP7和TIMP-2均为细胞周期阻滞的生物标志物。细胞周期阻滞在G1期可能是细胞避免发生DNA损伤的机制。在脓毒症造成AKI的大鼠模型中，肾小管上皮细胞进入短暂的G1期。当细胞经历压力或遭受损伤时，IGFBP7和TIMP-2在肾小管上皮细胞的表达上调[28]。IGFBP7和TIMP-2是最近被发现并验证的早期诊断AKI的生物标志物，其在成人和儿童队列中均有研究，尽管在成人和儿童中的水平不同，但诊断价值类似。IGFBP7和TIMP-2于2013年由KASHANI等[29]首次发现。KASHANI等[29]通过大规模、多中心研究，在522例有AKI风险的成人患者血浆和尿液样本中筛查了340种AKI病理过程中的相关分子，包括NGAL、KIM-1、L-FABP、IL-18等，发现IGFBP7和TIMP-2是最佳的生物标志物，AUC分别为0.77和0.75，并在728例危重症患者中验证这2个生物标志物，其乘积的AUC最大，12 h内预测中重度AKI（KDIGO 2或3期）的AUC为0.8，优于TIMP-2或IGFBP7单项检测。LIU等[30]的荟萃分析显示尿液TIMP-2与尿液IGFBP7的乘积是早期诊断成人AKI的可靠的生物标志物，其敏感性为83%，特异性为72%，合并ROC曲线的AUC为0.86。在婴儿和儿童AKI患者中，TIMP-2与IGFBP7的乘积也有很好的预测和诊断价值。CPB术后2 h AKI患儿尿液TIMP-2与尿液IGFBP7的乘积开始升高，12 h后达到峰值，预测AKI的AUC为0.71[31]，术后4 h的AUC为0.85，当最佳临界值为0.70（ng/mL）2/1 000时敏感性为83%、特异性为77%[32]。此外，尿液TIMP-2与尿液IGFBP7的乘积也可以有效预测新生儿和儿童AKI患者的不良结局（30 d和3个月的死亡率），其AUC为0.8左右[33]。因此，通过尿液TIMP-2与尿液IGFBP7的乘积可以对患者进行危险分层，预测并早期鉴别AKI高风险的患者，及时给予治疗干预，改善预后。

3 AKI生物标志物新兴检测技术的敏感性和多重性

目前，临床上常用基于酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的商品化试剂盒测定NGAL[9]、KIM-1[17]、IL-18[9]、L-FABP[9，22]。2013年，SABBISETTI等[34]建立并验证了2种检测尿液样本中KIM-1的方法，一种基于磁珠ELISA，另一种基于侧流免疫技术，2种方法的最低检测限分别为12.21和190 pg/mL。随着技术的进步，检测仪器的自动化程度逐渐提高，设备的体积也大幅缩小。CHUNG等[35]通过磁性纳米微颗粒检测信号，可以在一个手持设备上快速检测尿液KIM-1，便于临床应用，且检测最低限可达0.1 ng/mL。检测技术的多重性也逐渐提高。ZEIDAN等[36]通过一种实时、非标记、纳米增强的表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRi）技术同时超高敏感地检测KIM和高迁移率族蛋白1（highmobility group box-1，HMGB-1）2种生物标记物，其中KIM-1检测敏感性可达5 pg/mL。随着质谱仪器的不断发展，对复杂生物样本中的蛋白质绝对定量也逐渐实现。GILQUIN等[37]建立了一种基于蛋白质标准物绝对定量法（protein standard absolute quantification，PSAQ）的靶向蛋白组学检测方法，可以同时对尿液样本中NGAL、L-FABP、肌-肌醇加氧酶（myoinositol oxygenase，MIOX）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PCK1）4种AKI生物标记物进行准确定量。他们建立的PSAQ兼备了多重性、高敏感性、高特异性和高准确性的特点。新兴的AKI生物标记物检测技术向着高通量、多重性、更准确和更敏感的方向发展，这对于AKI的诊治有着重要意义，但这些技术离临床广泛应用还有一段距离，需要在实验室进行大规模临床样本验证。

4 联合检测AKI生物标志物的临床价值

AKI的病理生理学过程并不完全清楚，损伤过程可能涉及免疫反应、炎症反应等一系列复杂的细胞和分子信号通路，内皮细胞、肾小管上皮细胞、间质细胞以及许多免疫细胞均参与其中，而且病程是动态发展的，不同的生物标记物涉及AKI发展中不同的病理机制，没有单一的生物标志物能够准确判别AKI病程中的所有时期。因此，联合检测多种生物标志物可能有助于AKI的预测和诊断。许多相关研究也发现2～5个标志物联合检测可以提高AKI的诊断准确性[9，22，38]。DONG等[9]的研究结果显示，CPB术后12 h联合检测患儿尿液NGAL、IL-18和TIMP2，可将诊断AKI的AUC从0.938提高至0.973。唐荣等[22]的研究结果显示，术后2 及6 h尿液L-FABP及NGAL联合检测预测儿童CPB术后AKI发生的AUC分别为0.942和0.929。PARIKH等[38]在行心脏手术的成年患者和儿童患者队列中评价尿液KIM-1和L-FABP单项检测及联合其他肾损伤标志物诊断AKI的临床效能，结果显示术后联合检测尿液KIM-1和血浆NGAL的AUC为0.76，优于单项检测；成年患者联合检测尿液KIM-1、尿液IL-18和血浆NGAL的诊断价值最高（AUC为0.78），儿童患者尿液IL-18和L-FABP联合检测的AUC最高（0.78）。

5 AKI生物标志物对儿童患者的临床效能

目前的研究表明AKI生物标志物在儿童患者中的诊断价值与成人类似，甚至更好；但对儿童的研究远远少于成人，缺乏多中心大规模的儿童队列的验证。儿童有其独特的生长发育规律，随着机体的生长发育，肾脏逐渐发育成熟，肾功能不断完善，这些生物标志物的基线水平在儿童的不同年龄段是动态变化的。因此，AKI生物标志物在儿童患者中的临床效能不能完全套用成人的结论，其临床效能需在儿童队列中进一步验证。最近有研究报道了健康儿童尿NGAL、IL-18、KIM-1、LFABP的参考区间，从中可以发现这些标志物在儿童生长发育的不同年龄段有动态改变[39]。还有研究结果显示，6～11岁健康儿童TIMP-2与IGFBP7的乘积高于2岁以下儿童[33]，这点和成人不同，有可能是这些AKI生物标志物在成人和儿童中诊断效能不同的原因，也部分解释了不同的儿童患者的研究异质性较大的原因。现有的儿童AKI患者的研究结论需要在大规模多中心的队列中进行验证。试验的设计需要考虑到这些生物标志物年龄特异的基线水平，对照者也需要匹配相应的年龄段，否则有可能会导致研究结论出现偏差。建立我国健康儿童AKI生物标志物的参考区间将有助于了解与年龄相关的基线水平，对AKI患儿的诊治有重大意义。

6 总结

儿童AKI的发病率高、预后差。新的AKI生物标志物的研究将为AKI的早期诊断、风险预测及疗效评估带来希望，但也需要更加严谨的实验设计和更大规模队列的研究。由于各项AKI生物标志物来源于肾脏的不同部位，单一项目的临床效能不能满足临床需求，联合检测多种生物标志物可能有助于AKI的预测和诊断。AKI相关新型生物标志物及所处肾脏部位见表1。联合检测多种生物标志物时也可以尝试非线性组合之外的其他新的算法。同时，对肾脏损伤病理过程的分子基础学的深入研究将为AKI生物标志物的临床解释提供更可信的证据。

表1 AKI相关新型生物标志物以及所处肾脏部位