2种国产化学发光检测系统与电化学发光检测系统检测CA72-4的一致性评价

魏衍财，郑维玲，石 燕，宋妙丽，叶科学，卢 旬，杨 辰

（南京医科大学附属苏州医院医学检验科，江苏 苏州 215002）

糖类抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）作为一种较新的肿瘤标志物，对胃癌、卵巢黏液性囊腺癌和非小细胞肺癌具有相对较高的敏感性和特异性，可对这3类癌症进行动态监测，以指导治疗和预测肿瘤复发。目前，在实际工作中，由于不同检测系统之间影响因素较多，导致CA72-4的检测结果存在差异。2006年，卫生部办公厅印发《卫生部办公厅关于医疗机构间检验、医学影像检查互认有关问题的通知》要求实现检验结果的互认[1]。因此，评估不同检测系统之间的差异，为实验室间检测结果的互认提供基础。美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2013年8月发布了EP09-A3文件[2]，为生产厂家和临床实验室提供了最新的方法学比对和偏移评估方法。本研究参照EP09-A3文件，以电化学发光检测系统为参比方法，以2种国产化学发光检测系统为实验方法，对3种检测系统测定CA72-4的一致性进行了评价，为实验室和临床工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集南京医科大学附属苏州医院本部住院及门诊患者表观正常（无溶血、黄疸和脂血等）的新鲜血清样本，分装后于-80 ℃保存。共收集42份样本，其中CA72-4浓度分布为0～6.9 U/ mL（6.9 U/mL为CA72-4生物参考区间上限）的样本8份，6.9～50.0 U/mL的样本24份，50.0～300.0 U/mL的样本10份，比对数量符合CLSI EP09-A3文件要求（至少40份样本）。

1.2 试剂与仪器

cobas e601电化学发光免疫分析仪（瑞士Roche公司），MAGLUMI 4000全自动化学发光分析仪（深圳新产业公司），CL-2000i化学发光分析仪（深圳迈瑞公司），试剂、校准品均为各仪器配套试剂。肿瘤标志物质控品（批号54601、54602）购自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 比对系统 以cobas e601电化学发光免疫分析仪及配套试剂（电化学发光法）组成的检测系统（简称e601检测系统）作为参比系统（X），以MAGLUMI 4000全自动化学发光分析仪及配套试剂（化学发光法）组成的检测系统（简称MAGLUMI 4000检测系统）作为待评系统1（Y1），以CL-2000i化学发光分析仪及配套试剂（化学发光法）组成的检测系统（CL-2000i检测系统）为待评系统2（Y2）。

1.3.2 样本检测 测定之前校准仪器，并且室内质控在控。按照EP09-A3文件要求，同时使用3种检测系统随机单次测定42份血清样本，记录CA72-4检测结果。

1.3.3 离群值检查 根据EP09-A3文件要求，使用广义极端学生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法检验离群值。具体步骤：（1）根据42份样本的测定结果计算[（Y-X）/X]的平均值（）和标准差（s），并根据和s计算最大偏移（ESDi）；（2）根据检验统计的样本数量计算临界值（λi）；（3）若ESD1＞λ1，则认为该观察值为离群值，剔除后需进行第2个最大偏移的计算和比较；（4）离群值的个数通过找到最大的i，使ESDi＞λi来确定；（5）剔除离群值后，样本数量至少40份，如不足，需补充。

1.3.4 方法比对 绘制偏差图、散点图、柱状图。根据不同分析方法间浓度差值偏差图、百分比差值偏差图、浓度差值排序偏差图和百分比差值排序偏差图所呈现的潜在特征，选择最合适的回归模型（OLR、WLS、Deming、Passing-Bablok）对不同比对系统的结果进行回归拟合分析。

1.3.5 偏移估计 先进行偏移初步估计。绘制不同比对系统间差值频数柱状图，并分析柱状图特征。如为正态分布，则使用参数检验（均值）估算偏移；如为非正态分布，则使用非参数检验（中位数）估算偏移。根据以上得到的回归方程计算医学决定水平处的偏移，以≤1/2偏移（±7.65%）（数据来源于2016年上海市临床检验中心室间质评的平均偏移）为可接受标准。

1.4 统计学方法

采用Excel 2010、SPSS 16.0和MedCalc 9.2.0.1软件进行统计分析。选取最合适的回归模型计算不同比对系统的偏移，正态分布检验采用K-S检验，显著性检验采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 离群值检验

2.1.1 目测法检验离群值 采用3种检测系统测定CA72-4，绘制散点图。结果显示e601检测系统（X）与MAGLUMI 4000检测系统（Y1）的相关性良好[Y1=5.020 6+1.149 8X（r2=0.786 7）]，e601检测系统（X）与CL-2000i检测系统（Y2）的相关性良好[Y2=0.726 3+0.830 0X（r2=0.867 7）]。目测2个不同比对系统之间各有1个异常值。见图1、图2。

2.1.2 使用广义ESD法检验 根据CLSI EP09-A3文件中描述的广义ESD法进行离群值检验，结果显示未发现离群值。见表1。

2.2 方法学比对与偏移评估

2.2.1 不同比对系统方法间差值潜在特征分析及最佳回归模型选择 参照EP09-A3文件，绘制3种检测系统CA72-4检测结果浓度差值偏差图、百分比差值偏差图、浓度差值排序偏差图和百分比差值排序偏差图。e601检测系统与MAGLUMI 4000检测系统比较，CA72-4检测结果除低浓度波动较大外，总体变化恒定，故选择Deming回归模型进行拟合，见图3。e601检测系统与CL-2000i检测系统比较，差值呈现混合变化，故选择Passing-Baklok回归模型进行拟合，见图4。

图1 e601检测系统与MAGLUMI 4000检测系统测定CA72-4的散点图

图2 e601检测系统与CL-2000i检测系统测定CA72-4的散点图

表1 不同比对系统间离群值计算结果

2.2.2 偏移初步估计 正态分析发现，e601检测系统（X）与MAGLUMI 4000检测系统（Y1）差值呈非正态分布（P=0.048），图形为非钟形曲线[图5（a）]，因此采用中位数作为方法间偏移估算。经计算，42份样本百分比差值的中位数为-31.46%，大于可接受标准。e601检测系统（X）与CL-2000i检测系统（Y2）的差值为正态分布（P=0.548），图形为近似钟形曲线[图5（b）]，因此采用均值进行方法间偏移估算。经计算，42份标本百分比差值的均值为5.94%，小于可接受标准。

2.2.3 回归分析 根据CLSI EP09-A3文件及不同比对系统间CA72-4测定结果数值的变化特征，选取最佳回归模型进行拟合，将CA72-4的医学决定水平（6.9 U/mL）代入最佳回归方程。经计算，e601检测系统（X）与MAGLUMI 4000检测系统（Y1）的偏移大于可接受标准，e601检测系统（X）与CL-2000i检测系统（Y2）的偏移小于可接受标准。见表2。

图3 e601检测系统和MAGLUMI 4000检测系统测定CA72-4的偏差图

图4 e601检测系统和CL-2000i检测系统测定CA72-4的偏差图

图5 e601检测系统与MAGLUMI 4000检测系统、CL-2000i检测系统的百分比差值频数柱状图

表2 CA72-4医学决定水平在不同比对系统回归模型中的偏移结果

3 讨论

CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，具有较高的特异性，与糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）联合检测可以监测44.91%的胃癌。CA72-4水平与胃癌的分期有明显的相关性，一般在胃癌的Ⅲ～Ⅳ期增高，对伴有转移的胃癌患者，CA72-4的阳性率更远远高于非转移者[3]。CA72-4特别有助于卵巢癌检测，其与CA125及人附睾蛋白4 （human epididymis protein 4，HE4）联合检测，可作为诊断原发性及复发性卵巢肿瘤的生物标志物[4]。目前，临床实验室检测CA72-4的方法包括放射免疫分析、酶联免疫法、化学发光法以及电化学发光法等，尤以化学发光法和电化学发光法应用最为广泛。但由于不同方法间CA72-4检测结果差异较大，故有必要研究不同方法间检测结果的一致性。

自CLSI EP09-A3文件发布以来，尚未见其在标记免疫领域的应用。EP09-A3文件可用于制造商测量程序声明比对方法的建立、确认以及临床实验室新引进测量程序的方法比对验证。EP09-A3要求比对样本应使用未经处理的患者标本，浓度范围覆盖测量范围。如需使用处理过的样本（如混合样本），数量应不超过总样本数的20%。相比于EP09-A2文件[5]，EP09-A3文件作了很大修改。在比对数量方面，EP09-A2文件要求检测至少40份样本，按照顺序双次测定；EP09-A3文件规定至少40份样本，可单次随机测定，操作更加方便。在离群值判断方面，EP09-A2文件要求通过方法内和方法间差值与规定的可接受值进行比较，检查是否存在离群值；EP09-A3文件采用广义ESD法判断离群值，从单变量数据集中检测离群值，当异常值的数量未知时，假定绝大多数数据点的分布是正态分布，经过计算及与临界值的比较，判断是否为离群值，该方法随着样本数量的增加而变得更加可靠。在选取回归模型和偏移计算方法方面，EP09-A2文件规定方法间差值仅使用简单的线性回归模型进行拟合，使用分布残差法计算平均偏移；EP09-A3文件提供了4种回归模型，首先可利用散点图和偏差图进行目测分析，并以不同方法间测定结果的数据特征选择合适的模型进行拟合，再根据回归方程计算医学决定水平处的偏移，数据分析更加科学。EP09-A3文件的应用更加广泛，方案设计更加合理，可操作性更强，为临床实验室引进新的测量程序进行方法比对和偏移评估提供了新的依据。故本研究使用EP09-A3文件提供的比对方法作为指导。

由于e601检测系统在本实验室已使用较长时间，参加上海市临床检验中心室间质评成绩优秀，不精密度＜4%，因此将其作为参比方法，以2种国产化学发光检测系统（MAGLUMI 4000检测系统和CL-2000i检测系统）作为实验方法。由于不同厂家使用的仪器、试剂中抗体针对的被测物质抗原表位、底物不同，且无统一的溯源标准，从而导致了e601检测系统与MAGLUMI 4000检测系统测定CA72-4存在较大的差异，这与宋超等[6]的研究结果（4种进口全自动化学发光免疫分析系统检测CA19-9的结果无法完全互认）一致。在实际应用中，对于不具有可比性的检测系统，各临床实验室可分别建立自己的参考区间。对于CA72-4项目的允许总误差，未查阅到相关标准，也没有相关文献报道，因此本研究将2016年上海市临床检验中心室间质评中CA72-4项目平均偏移的1/2作为偏移的可接受标准。

总之，本研究以CLSI EP09-A3文件作为指导，将2种国产化学发光检测系统与e601检测系统的CA72-4测定结果进行比较，评价其一致性，为临床实验室选择检测方法提供一些参考。