CD123和CD66c在儿童B-ALL中的表达及其在MRD监测中的应用

钟嘉颖，吴英英，劳梦晓，张小艳，王春丽，潘建华

（1.广州医科大学，广东 广州 510182；2.广州金域医学检验中心临床血液流式细胞检测中心，广东 广州 510005）

多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MFC）是儿童急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）免疫分型和微小残留病（minimal residual disease，MRD）检测的重要方法。MRD检测可用于B-ALL患儿的疗效判断和预后评估。MFC是MRD检测的关键，其难点在于对正常B系前体细胞与B-ALL肿瘤细胞进行区分。CD123，即白细胞介素（interleukin，IL）-3受体α链，是造血生长因子受体家族成员之一。CD123在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）干细胞和淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中异常表达[1-3]，但在儿童B-ALL中的表达特点有待进一步确认。CD66c是癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）基因家族成员之一，属非特异性交叉反应性抗原，主要分布于粒细胞、结肠和肺上皮细胞中，在部分成人及早期B-ALL患儿中高表达[4-5]。本研究采用MFC对CD123和CD66c在141例B-ALL患儿中的表达特点进行分析，并探讨二者在MRD监测中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年6月—2017年6月送检广州金域医学检验中心临床血液流式细胞检测中心的初诊B-ALL患儿标本141例，患儿男80例、女61例，年龄4（1～14）岁，所有病例均经世界卫生组织细胞形态学（morphology）、免疫学（immunology）、细胞遗传学（cytogenetics）和分子生物学（molecular biology）分型（MICM分型）确诊。另选取25例AML患者作为对照组，经治疗症状完全缓解后采集其骨髓标本，所有标本均含比例不等的正常增生B系前体细胞。

1.2 仪器与试剂

选用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）。单克隆抗体包括异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP） -Cy5.5、PE-Cy7、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）、APC-H7、V450和V500标记的鼠抗人CD5、CD10、CD20、CD19、CD22、CD123、CD38、CD34、CD33、CD117、CD13、CD7、CD3、IgM、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）、CD45等，均购自美国BD公司。IntraPrep破膜剂购自法国Immunotech公司。溶血素为美国Beckman Coulter公司产品。

1.3 方法

1.3.1 抗体标记及流式细胞术分析 将初诊患儿骨髓有核细胞数调至1×105/100 μL，采用多色直接免疫荧光标记法进行染色。每管加入100 μL标本，染色前用10 μL小牛血清常温封闭10 min，以阻断Fc受体，加入相应单抗，对细胞表面及胞质内的抗原进行检测。对照组骨髓淋巴细胞CD123和CD66c检测方法同初诊患儿。使用Diva软件获取0.6×105个细胞，并进行分析，细胞表面及胞质内抗原检测结果以表达＞20%为阳性。

1.3.2 CD123和CD66c在正常B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中的表达 采用流式细胞仪检测对照组经治疗症状完全缓解后的骨髓标本，以CD45/SSC设门，当CD45弱阳性、怀疑为正常增生B系前体细胞时，选取CD66c/CD123/CD34/CD10/CD19/CD38/CD45抗体组合，进一步分析CD123和CD66c在正常B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中的表达情况。

1.3.3 B-ALL患儿治疗后MRD检测 当初诊患儿抗原表达不同于对照组（CD123、CD58强表达，CD38、CD45阴性或弱表达，CD13、CD33和CD66c跨系表达）时，选取CD10/CD34/CD19/CD45做进一步MRD抗体组合检测。B-ALL患儿治疗后骨髓标本用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，2 000×g离心20 min，吸出白膜层，再用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤2遍，调节单个核细胞数至合适的量。每管加入100 μL标本，用10 μL小牛血清常温封闭10 min后加入相应单抗，对细胞表面抗原进行检测，每管尽量多地获取细胞（4×105～10×105个细胞），分析MRD水平，MRD≥0.01%为阳性，MRD＜0.01%为阴性，MRD＞5.00%为复发。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以x± s表示，呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用单因素方差分析或秩和检验，采用Spearman法分析相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD123和CD66c在正常B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中的表达

对照组正常B系前体细胞占有核细胞总数的[7.63（1.76～21.82）]%。根据CD19、CD10、CD34和CD45的表达特点可将正常B系前体细胞分为：（1）CD10荧光强度最强而CD45荧光强度较弱的细胞群，该细胞群CD34阳性，为较早期的B祖细胞（CD19+CD34+）；（2）CD10荧光强度较弱而CD45荧光强度较强的细胞群，该细胞群CD34阴性，为较晚期的B系前体细胞（CD19+CD34-）。CD123在CD19+CD34+和CD19+CD34-上的表达水平分别为[0.46（0.00～2.47）]%和[0.10（0.10～1.07）]%，CD66c的表达水平分别为[0.42（0.00～1.65）]%和[0.21（0.10～1.21）]%。CD123和CD66c在正常B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中均不表达。

2.2 CD123和CD66c在儿童B-ALL中的表达

141例B-ALL患儿中分别有6例、123例和12例为早期前体B-ALL（Pro-B-ALL）、普通B-ALL（Common-B-ALL）和前体B-ALL（Pre-B-ALL），其中CD123阳性88例（62.41%），CD66c阳性70例（49.65%），CD123和CD66c均阳性62例（43.97%），CD123或CD66c阳性96例（68.09%）。经Spearman法相关性分析，CD123和CD66c与儿童B-ALL表达呈中度正相关（r=0.641，P＜0.01）。见表1。

2.3 MRD抗体组合检测

CD123和CD66c在B-ALL肿瘤细胞中的表达不同于正常B淋巴细胞（B系前体细胞和成熟B淋巴细胞），以抗原阳性率≥90%作为治疗后MRD监测的指标。141例B-ALL患儿中，CD123或CD66c阳性共96例（68.09%），45例选择CD123用于监测，52例选择CD66c用于监测，选择CD123和CD66c用于监测的病例有35例，选择CD123或CD66c用于监测的病例有62例，覆盖率为43.97%。监测指标除CD123和CD66c外，还包括CD38、CD45阴性或弱表达，CD58强表达，CD13、CD33跨系表达。见表2、图1。

表1 CD123和CD66c在儿童B-ALL中的表达水平

表2 CD123和CD66c在B-ALL患儿MRD监测中的应用[例（%）]

图1 CD123在B-ALL患儿MRD监测中的应用

3 讨论

采用流式细胞术分析儿童B-ALL治疗后MRD水平时，受化疗或骨髓移植后骨髓增生期的影响，B-ALL患儿的骨髓中会出现造血B系前体细胞数量一过性增加的情况，此阶段出现的CD19、CD10双阳性群体来源于正常造血细胞克隆还是来源于恶性血细胞克隆，需谨慎判断。目前，形态学方法较难区分正常B系前体细胞与B-ALL肿瘤细胞，且二者的免疫表型也十分相似，故B-ALL的MRD监测主要依赖于正常B系前体细胞免疫表型存在明显差别的抗原[6-7]。本研究结果显示，141例B-ALL患儿中CD123表达阳性88例，阳性率为62.41%；CD66c表达阳性70例，阳性率为49.65%。然而，CD123和CD66c在骨髓正常增生B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中均不表达。本研究结果和文献报道结果都显示骨髓正常增生B系前体细胞和成熟B淋巴细胞均无CD123和CD66c表达[8-10]，提示CD123和CD66c均可作为儿童B-ALL的MRD监测指标。

用于B-ALL MRD监测较好的指标不仅需要在白血病细胞上特异表达，而且还要在化疗后残留肿瘤细胞上稳定表达。本研究MRD监测结果显示，CD123和CD66c表达均具有良好的稳定性，无衰减或变弱，对CD123和CD66c阳性白血病细胞群的判断和分析较为容易。经与其他指标（CD58、CD38、CD33和CD13）进行比较发现，CD33和CD13稳定性不够，复发时部分病例表达减弱或缺失，一些病例的CD58和CD38受荧光强度较正常B系前体细胞分界不明显的影响，未能较好地对白血病细胞进行辨别。因此，CD123和CD66c是儿童B-ALL MRD监测稳定、特异、敏感的指标。

本研究中141例B-ALL患儿有96例CD123或CD66c阳性（阳性率为68.09%），CD123和CD66c共同用于MRD监测的病例有35例，表明CD123和CD66c常共同表达于B-ALL白血病细胞表面，且经Spearman法相关性分析，CD123和CD66c与儿童B-ALL呈中度正相关（r=0.641，P＜0.01）。因此，CD123和CD66c同时用于儿童B-ALL诊断和MRD监测具有较好的准确性。随访期间观察到2例复发患儿，复发B-ALL肿瘤细胞表面CD123和CD66c表达强度与初诊时一致，但由于治疗后复发的病例数较少且随访时间较短，CD123和CD66c在MRD监测中的稳定性尚需通过增加病例和延长随访时间来进行评估。本研究中CD123或CD66c用于MRD监测的病例仅62例（覆盖率为43.97%），需联合其他多个筛选指标进行检测，以提高MRD监测的覆盖率，同时还可有效减少因化疗导致部分患者免疫表型改变而出现的不真实监测结果。