冬凌草甲素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移能力及E-钙黏蛋白和波形蛋白表达的影响*

史国军 叶兴涛 屠小龙 施 航 董 晶 陆 宁 何国浓

浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315010

冬凌草甲素是中药冬凌草的主要活性成分，在冬凌草中占0.68%[1]，对肝癌、肺癌等多种癌细胞具有很强的抑制功效，作用机制复杂。本研究重点观察冬凌草甲素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移能力的影响及其作用机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及药物：人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院上海细胞生物研究所。冬凌草甲素（Oridonin）购于Sigma公司，货号：28957-04-2。

1.2 主要试剂及仪器：四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购于美国Hyclone公司，10%胎牛血清购自杭州四季青公司。Vimentin一抗：杭州华安生物技术有限公司，货号：ET1610-39。E-Cadherin一抗：杭州华安生物技术有限公司，货号：ET1607-75。倒置显微镜(COIC4365)购于日本Nikon公司，精密电子天平（美国Ohaus，型号AR1140），OD值测量仪器(高精度分光光度计)为NANODROP2000。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 细胞培养：从液氮罐中取出细胞株，快速解冻复苏于细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，24h换液1次。待细胞融合度达到80%～90%时，加入适量的0.25%胰酶消化，离心收集细胞，再用适量DMEM高糖培养液重悬细胞，转移细胞悬液至两个培养瓶中继续培养，细胞传代3次后可用于实验。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖能力：取对数生长期的细胞SMMC-7721，5×103/孔接种于4个96孔板，每孔培养液为200μl，预培养24h后进行实验。每板按照分组加入含不同浓度冬凌草甲素的完全培养液，使其终浓度为空白组（0μmol/L）、低剂量组（8μmol/L）、中剂量组（16μmol/L）和高剂量组（32μmol/L），每组8个复孔，继续培养。分别再培养24、48、72、96h后终止培养。加MTT液(2㎎/ml)20ml/孔，再培养4h，离心弃上清液，加DMSO180μl/孔显色。用酶标仪在波长570nm下读取吸光度(OD)值。

1.3.3 划痕实验检测细胞迁移能力：检测不同浓度冬凌草甲素处理后对细胞SMMC-7721迁移能力的影响，取细胞对数生长期制备单细胞悬液，将2×105/ml细胞/孔接种于24孔板，于37℃、5%CO2培养箱内孵育10～12h后，在90%融合的单层细胞表面划出一无细胞的细痕，用基础培养液漂洗数次清洗划痕道上的细胞。加入无血清的培养液继续培养，观察48h后细胞迁移到划痕区的情况，采用ImageJ软件计算迁移到划痕区细胞的单位面积数值变化，每组设3个复孔。

1.3.4 WesternBlot法检测E-钙黏蛋白（E-cad）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平：各组作用48小时后，蛋白裂解液裂解细胞后提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。丙烯酰胺凝胶垂直电泳，半干转膜法转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%脱脂牛奶室温封闭1h。加一抗稀释液4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液（PBST）洗膜10min×3次。加入不同稀释比的二抗稀释液室温孵育1h，PBST缓冲液洗膜10min×3次。ECL化学发光，暗室胶片显影后，Image-Pro Plus5.0软件计算条带光密度值。

1.4 统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，方差齐性采用单因素方差分析，用LSD法进行组间两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响：见表1。

表1 冬凌草甲素对人肝癌 SMMC-7721细胞体外抑制OD值比较(±s)

表1 冬凌草甲素对人肝癌 SMMC-7721细胞体外抑制OD值比较(±s)

注：与空白组比较，*P＜0.01，与低剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

空白组低剂量组中剂量组高剂量组0.371±0.065 0.132±0.032*0.046±0.011*▲▲0.043±0.008*▲▲0.093±0.005 0.093±0.008 0.099±0.007 0.098±0.007 0.156±0.019 0.087±0.005*0.071±0.005*▲0.070±0.014*▲0.181±0.016 0.093±0.007*0.059±0.003*▲▲0.053±0.009*▲▲0.335±0.016 0.119±0.008*0.052±0.004*▲▲0.039±0.006*▲▲

2.2 各组细胞迁移能力比较：根据初步的细胞增殖实验，确定冬凌草甲素作用48小时来进行实验。结果见表2。

表2 冬凌草甲素对细胞SMMC-7721迁移能力的影响

2.3 各组E-cad和Vimentin的WesternBlot法检测：见表3。

表3 冬凌草甲素对各组E-cad和Vimentin表达的灰度比值比较（±s）

表3 冬凌草甲素对各组E-cad和Vimentin表达的灰度比值比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与低剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

空白组低剂量组中剂量组高剂量组6 6 6 6 0.519±0.055 0.633±0.0156**0.718±0.048**▲▲0.756±0.027**▲▲0.711±0.051 0.627±0.046*0.544±0.061**▲0.538±0.073**▲

3 讨论

冬凌草又名延命草，素有“人间仙草”的美称，是唇形科香茶菜属植物碎米亚桠的全草，发源于济源太行、王屋山区。《中华人民共和国药典》记载，冬凌草，味甘苦，性微寒，具有清热解毒、健胃活血、消炎止痛和抗肿瘤等功效。冬凌草甲素是其抗癌最主要的活性成分之一。既往研究表明，冬凌草甲素抗肿瘤机制包括抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，降低端粒酶活性，抑制肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白质的合成，对肿瘤细胞周期的影响等［2］。E-cad属于钙黏蛋白超家族，是最重要的细胞上皮表型，介导细胞之间的黏附，维持细胞结构和形态的稳定[3]。研究表明，E-cad的异常表达与肝细胞癌浸润、转移有密切关系[4]，其不仅能促进肝癌细胞转移，还能诱导肝癌细胞的干细胞化。研究还发现[5]，肝癌中Vimentin表达增高，且同uPA的表达呈正相关，可能在肝癌的浸润转移中发挥重要作用。本次研究发现，冬凌草甲素可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，抑制细胞迁移能力，并且呈剂量-时间依赖性，与之前的研究报道一致[6]。进一步的机制研究表明，冬凌草甲素可增强E-cad表达，下调Vimentin表达，且与剂量相关。实验结果表明冬凌草甲素可抑制肿瘤上皮细胞-间充质细胞转化过程，从而抑制肿瘤增殖和迁移侵袭能力，为冬凌草应用于临床提供了有力的理论及实验依据。本课题组还将对冬凌草甲素其他抗肿瘤机制，做进一步的深入研究。