多器官功能障碍综合征患者外周血单个核细胞内PPARγ和COX-2的关系*

徐 飞， 乔万海

1.西安交通大学附属3201医院急诊科(汉中 723000),2.西安交通大学第二附属医院急诊科(西安710004 )

主题词 多器官功能衰竭/病理生理学 过氧化物酶体增殖物激活受体γ/分析 环氧合酶2/分析 单核细胞

多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)发病率及病死率很高，还没有令人满意的治疗措施。很多研究表明炎性因子在MODS的发生发展中起决定性作用。持续高水平存在的炎性因子提示发生MODS的可能性大大增加。涉及MODS的炎性因子种类很多，相互之间作用复杂，呈现出“网络性”的特点。因此，治疗MODS的热点就集中在如何调节炎症因子，阻断炎症的发展。当前，过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferater-activated receptor，PPARs)在MODS发病机制中起的作用日益受到关注。研究发现PPAR作用的范围很广，在脂类代谢、糖代谢，细胞的增殖、分化、凋亡，创伤愈合及炎症中均发挥非常重要的作用。PPARs[1]包括PPARα、PPARβ和PPARγ3种亚型。在实验中发现PPARγ及其配体在细胞的分子水平上具有调控炎症反应及免疫应答的作用，PPARγ通过调节COX-2的活化来实现对各类免疫因子进行免疫调节作用。环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGS)合成过程中一个关键的限速酶，它能够将花生四烯酸代谢为各种前列腺素产物，参与机体重要生理活动。环氧合酶(COX)主要有COX - 1(Cyclooxygenase-1，COX-1)和COX - 2(Cyclooxygenase-2，COX-2)两种异构体。COX-1在各种组织中微量表达，使细胞结构稳定，参与机体正常生理活动。COX -2属于诱导型酶，正常组织中不表达或微量表达，但在机体遭遇“严重创伤、感染、休克”等刺激因素时，COX-2的表达快速增加[2]，诱导多种PGs的合成，导致机体的炎症反应被放大及连续发展，同时COX-2被激活后可以抑制TNF-α等细胞因子的释放，具有抗炎作用。花生四烯酸通过COX-2生成的代谢产物15-去氧-△-(12，14)前列腺素J2(15d-PGJ2)，是PPARγ最重要的内源性天然配体，与PPARγ结合，通过抑制COX-2的活性，从而抑制各种炎症因子的表达，其合成受COX-2的调控；另外，15d-PGJ2能够与核内的PPARγ受体相结合，通过PPARγ-COX-2负反馈通路下调COX-2的活性。

资料与方法

1 一般资料 选择2015年1月至2017年1月在本院ICU的MODS患者60例为实验组。按患者急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分分为MODS1组(APACHEⅡ评分0～10分)，MODS 2组(APACHEⅡ评分11～20分)，MODS 3组(APACHEⅡ评分>20分)三组，每组20例。以同期20例年龄、性别、体质无统计学差别的本院健康体检人群作为健康对照组。60例MODS患者均符合2001年国际脓毒症会议关于MODS的诊断标准。排除标准：①不符合MODS诊断标准；②年龄<18岁，孕妇或哺乳期妇女；③服用抗肿瘤药物、接受放、化疗，使用免疫抑制剂等治疗患者，白血病、淋巴瘤、艾滋病、白细胞减少症患者。60例MODS患者，男36例，女24例，平均年龄(56.7±13.2岁)；20例健康对照组体检人群中，男10例，女10例,平均年龄(51.8±12.48岁)。本研究符合医学伦理学标准，获得医院伦理委员会审核批准。

2 主要试剂和仪器 ①人外周血淋巴细胞分离液 (北京市生物制品科技有限公司)；②mRNA检测：RNA总RNA抽提试剂盒、二步法RT-PCR试剂盒、AMVcDNA第一链合成试剂盒、即用PCR扩增试剂盒均购自先锋技术有限责任公司Taq DNA聚合酶、PCR Markers( Promega,美国)；TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，摄影显微镜(OLYMPUS-BH-2)(日本Olymapus公司)，台式冷冻高速离心机(Haerus，西德)，紫外分光光度计(Gene Quant pro英国 )超低温冰箱 (Sanyo日本)DNA热循环仪(Perkin Elmer，美国)，凝胶成像系统 (Bio-RAD Laboratories-Segrate意大利)

3 检测指标及方法

3.1 标本采集：所有患者于确诊后1d、3d、6d分别抽取外周静脉血2ml，用于检测PPARγ和COX-2mRNA表达水平。健康对照组20例于体检当日抽取2ml静脉血检测。

3.2 外周血单个核细胞(PBMCs)分离：采用Ficoll密度梯度法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，将分离出的单个核细胞加入1ml裂解液-70℃冻存，待一次测定。

3.3 总RNA提取：采用RNA抽提试剂盒提取总RNA，按说明书步骤操作。用紫外分光光度计测定总RNA的吸光度值(A260/A280)，结果均在1.8～2.0，说明所提取的RNA纯度高。

3.4 PPARγ、COX-2表达测定：PPARγ上游引物(5’-3’)：TCCACCTTATTATTCTG；下游引物(5’-3’)：ATTTGTCTGTTGTCTTTCC。内参β-肌动蛋白(β-actin)上游引物(5’-3’)： -ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-A下游引物(5’-3’)：-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-。COX-2上游引物(5’-3’)：5’-TGGTCTGGTGCCTGGTCTGg-3’；下游引物(5’-3’)： -CTGCCTGCTCTGGTCAATGG-3；(引物序列由北京奥科生物科技公司合成)。在PCR仪上进行RT-PCR。总体积77.4μl：2×Taq PCR MasterMix 25μl，ddH2O 50μl，PPARγ或β-actin上下游引物各1.0μl，cDNA模板0.4μl。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，进行35个循环。吸取RT-PCR反应产物5μl，与1μl DNA上样缓冲液充分混合均匀。1.8%琼脂糖凝胶上80v恒压电泳45min，0.5μg/ml溴化乙啶溶液中染色10 min。电泳完毕后，紫外灯下观察结果，并进行照像。

3.5 图像采集分析：应用BIO-PROFIF图像分析系统行灰度扫描，将各组β-actin条带的扫描值做为标准，计算PPARγmRNA/β-actin、NF-kBp65mRNA/βactin吸光度比值，记录PPARγmRNA、 COX-2p65mRNA的相对表达量。

结 果

1 PBMCs中PPARγ mRNA表达量的变化 见表1。PBMCs中PPARγ mRNA表达量较少，与正常组比较，MODS1组PPARγ mRNA表达随时间推移越来越高，至第6天达峰值(P<0.05；P<0.01)，以此类推。MODS2组、MODS3组PPARγ mRNA的表达随时间越来越低，至第6天降至最低(P<0.05；P<0.01)。同时间点PPARγ mRNA的表达在MODS3组与MODS2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MODS2组、MODS3组与MODS1组比较有差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 PBMCsPPARγ mRNA在不同组表达

注：与正常对照组比较，*P<0.05 ，△P<0.01； 与MODS1组比较，#P<0.05

2 PBMCs中COX-2 mRNA表达量的变化 见表2。正常组外周血单个核细胞中COX-2mRNA表达量较少，与正常组比较，MODS1组COX-2 mRNA表达随时间推移越来越低，至第6天降至最低(P<0.05；P<0.01)，以此类推，MODS2组、MODS3组COX-2mRNA的表达随时间推移越来越高，至第6天达峰值(P<0.05；P<0.01)。同时间点COX-2 mRNA的表达在MODS3组与MODS2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MODS2组、MODS3组与MODS1组比较差异有统计学意义(P<0.05) 。

表2 PBMCsCOX-2mRNA在不同组表达

注：与正常对照组比较，△P<0.01 ； 与MODS1组比较，#P<0.05

3 PPARγ与COX-2相关性分析 PBMCs中PPARγ与COX-2的表达在MODS1组，MODS2组，MODS3组呈负相关性(MODS1组r=-0.761，P<0.01 ；MODS2组：r=-0.782，P<0.01；MODS3组r=-0.791，P<0.01)。在正常对照组无明显相关性(r=0.183，P>0.05)。

讨论

多器官功能障碍综合征(MODS)是患者机体受到严重感染及创伤等损害后序贯出现的2个或2个以上器官或系统功能障碍的临床综合症[3]。MODS发病凶险，机制复杂，致死率高。目前研究认为，炎性介质的大量释放形成放大的、失控的炎症“瀑布样”的连锁反应，使器官功能损害，最终发生MODS。

越来越多的研究表明，PPARγ在调控炎症反应的过程中扮演非常重要的角色。有关PPARγ抗炎作用的研究发现PPARγ通过抑制NF-κB的活化来实现对各类免疫因子抑制。研究发现，PPARγ配体可以阻止单核-巨噬细胞发生炎症反应，生成抗炎与(或)脱敏的表型。PPARγ已经成为调控单核细胞基因表达的新靶点[4]。许多研究[5]证明，PPARγ发生活化后能够和NFAT及COX-2产生物理作用，以阻断其下游转录因子表达活化。

本研究显示：MODS1组PPARγ表达水平高于正常对照组(P<0.05)，随着治疗时间增加，PPARγ的表达水平随病情好转进一步升高。而MODS2组、MODS3组PPARγ的表达水平低于正常对照组(P<0.05)，PPARγ的表达水平随病情加重而降低，表明PPARγ的表达与MODS的发生、发展密切相关。MODS发生早期PPARγ表达升高，此过程对机体有益，炎症被抑制，器官功能好转。随着病情加重，PPARγ表达进行性下降，炎症因子失控性释放，脏器功能损伤进一步加重。证实了PPARγ在MODS中具有阻断炎症反应，保护脏器功能的作用。

研究发现，环氧化酶(Cyclooxygenase)是一类重要的限速酶，使花生四稀酸(AA)被分解为前列腺素类物质，是炎症反应的中心环节。其中一种产物15d-PGJ2，是PPARγ非常重要的天然配体，能够与PPARγ结合抑制炎症反应，其合成受COX-2的调控[4]。COX-2的高表达能够增加15d-PGJ2合成，经过激活PPARγ，抑制NF-κB而表现出抗炎的作用，另一方面， 15d-PGJ2与PPARγ的受体相接合，通过PPARγ-NF-κB负反馈通路，使COX-2活性下调[4]。因此COX-2具有双重功能。

研究表明，COX-2与PPAR-γ呈负相关。COX-2是NF-κB 的下游调控物质。PPAR-γ能抑制NF-κB，进而抑制TNF-α、COX-2的表达。更多的研究表明，在MODS中，PPAR-γ能够抑制COX-2的表达及前列腺素2(PGE2)的生成。Bren-Mattison[5]研究表明，PPAR-γ通过激活过氧化物酶体增殖子反应元件(PTEN)和抑制蛋白酶B(Akt)两种途径，抑制NF-κB的表达，并下调COX-2的表达，二而一之该途径的胰岛素抵抗，肝内脂肪沉积。Inoue等[6]报道，COX-2催化产生的PGD2的代谢产物15d-PGJ2是体内最强大的内源性PPAR-γ配体。当COX-2表达降低时，15d-PGJ2的产生下降，使PPARγ的作用减弱。COX-2 是15d-PGJ2合成过程中的重要限速酶，而15d-PGJ2又是PPAR -γ 的天然配体，这提示 PPAR-γ 可能作为 COX-2的下游基因参予疾病的过程[7]。PPAR-γ 激活抑制炎症反应的机制主要是通过抑制 NF-κB 活化，从而抑制多种细胞因子和炎症因子(如 IL-1，IL-8，TNFα等)表达[8]。它还可通过反馈机制调控 COX-2 的表达[9]。在本次研究中，正常对照组中COX-2含量及其mRNA表达均明显低于MODS患者，而且存活患者明显低于死亡患者，说明细胞内COX-2含量与病情轻重有紧密联系。COX-2基因上含有NF-κB的结合位点，LPS，TNF-α，自由基等外界因素可激活NF-κB，NF-κB与COX-2基因位点结合后导致COX-2的表达增加。NF-κB是介导基因转录的枢纽，参与了机体防御功能、炎性反应等有关的早期应答调控。因此，对NF-κB及其靶基因COX-2活化过程的研究，成为许多疾病重要的治疗手段[10]，

本研究显示：MODS1组COX-2的表达水平高于正常对照组(P<0.05)，随着治疗时间增加，COX-2的表达水平随病情好转而降低。提示COX-2通过其下游产物15d-PGJ2参与了MODS的发生，发展。15d-PGJ2是PPARγ最强的天然配体， PPARγ表达升高，从而阻断炎症的瀑布效应，抑制炎症因子的释放，反馈抑制COX-2的活性，器官功能受损减轻，表明COX-2有减轻MODS患者多器官功能不全的作用。而MODS2组、MODS3组COX-2的表达水平明显高于正常对照组(P<0.01)。随着病情进展，COX-2表达进行性升高，炎症因子失控性释放，脏器功能损伤进一步加重。

PPARγ的抗炎特性已经被人们广泛的接受，提示PPARγ在防治MODS上具有重要的作用。本研究基于课题组以往的实验研究[11]，再次探讨了PPARγ、COX-2在MODS患者不同阶段的相互作用机制，但由于临床研究过程中各种治疗药物的干预以及无法使用激动剂，拮抗剂等诸多条件限制，PPARγ、COX-2等炎症因子在人体内的关系及作用仍很复杂，研究仍较局限。还有很多未知领域值得我们进一步临床研究来证实其作用，以更好的应用于临床。