富血小板血浆联合骨碎补对兔前交叉韧带重建术后腱骨愈合及生物力学的影响*

李炜峰，占 龙，李张生，李小峰，杨 渊

1．广西中医药大学(南宁 530001)，2．广西骨伤医院(南宁 530012)，3．广西医科大学附属琅东医院(南宁 530012)

主题词 骨碎补 富血小板血浆/治疗应用 前交叉韧带 骨折愈合 生物力学现象 兔

前交叉韧带(Anterior cruciate ligament，ACL)是膝关节重要的静力和动力性稳定结构，由纵行排列的胶原纤维束构成，并在较大的功能束内形成紧密的簇状结构。ACL损伤后难以自愈，易常造成严重膝关节不稳，继发半月板损伤和骨关节炎。目前多建议行手术重建ACL[1]。重建后腱骨愈合情况是手术成功的关键因素，因此，如何促进重建术后腱骨愈合也成为当前研究的热点。骨碎补是骨伤科常用的药物，中医认为其具有补益肝肾，强筋接骨，通络止痛的功效，可改善骨代谢，因此常用于骨折，骨质疏松等疾病的治疗，效果确切[2-3]。富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)是自体静脉血经离心后获得的含多种生长因子的血液制品，这些因子在肌腱愈合中可促进细胞增殖、胶原合成、炎性趋化[4]。本研究在兔行ACL重建术后在骨髓道中注入PRP并口服骨碎补，同时与对富血小板血浆组、骨碎补组、空白组相比，术后12周取材行Micro-CT扫描及三维重建，测量骨隧道内口扩大宽度及腱骨界面处骨密度(Bone mineral density，BMD)并行生物力学测定，评估各组对前交叉初带重建后腱骨愈合及生物力学的影响。

材料和方法

1 实验动物 本研究共使用 72 只骨骼成熟的新西兰白兔，由广西医科大学动物实验中心提供，许可证号 ：SYXK(桂)：2014-0003，雌雄不限，6月龄，体质量约 3 kg，根据国际实验动物科学理事会关于实验室动物的护理和使用指南进行喂养，将它们饲养在单独的笼中，标记并允许自由移动、自由进食与饮水，在实验开始之前实验动物在笼子里至少喂养 14 d，以驯化达到实验条件。

2 仪器与试剂 台式离心机(LD5-2A 型，北京医用离心机厂)，骨碎补(广西骨伤医院药剂科提供。水煎浓缩成含药物浓度1 g/ml的药液备用)，青霉素，电钻，2 mm克氏针，戍巴比妥，4%多聚甲醛，0.5%碘伏，酒精，数码相机，自动剃毛机，Skyscan 1176 Micro-CT机(德国Bruker公司)，Zwick IZ010型万能材料测试机(德国Zwick/Roell公司)。

3 PRP的制备 采用含 0.8 ml 10% 枸椽酸钠的注射器，于每只兔耳中央动脉抽取 5 ml 动脉血。采用 Landesberg 法[5]制备 PRP ：两次离心转数均为1100转/min、离心半径为15cm，时间均为8min，全血分为3层，取上清、交界层及交界层下少量红细胞行二次离心，吸除上层贫血小板血浆，剩余1 ml即为富血小板血浆，加入微量(0.1 ml)激活剂氯化钙。

4 实验分组及方法 将 72 只大白兔随机分成四组(n=18)，分别为富血小板血浆联合骨碎补组，富血小板血浆组，骨碎补组，空白组，每组随机取一侧下肢行自体单股半腱肌腱移植重建ACL。手术前禁饮食 12 h，术前术区备皮、称重，以 2.5%戊巴比妥钠(40mg/kg)静脉麻醉；0.5%碘伏消毒术野、铺巾。沿膝关节髌骨旁内侧缘作一长约3 cm的纵行切口，依次切开皮肤，皮下组织，剥离半腱肌腱，在肌腱、肌肉结合处断开，用4-0强生缝合线编制缝合。继续分离关节囊，直至暴露前交叉韧带，用眼科剪在韧带的股骨及胫骨附着点切断(图1、2)。用直径2 mm钻头制备胫骨及股骨隧道，将单股肌腱拉入骨隧道中，将丝线收紧打结，并将肌腱缝合于隧道外口周围软组织上，行悬吊固定，实验组及富血小板血浆组胫骨、股骨骨隧道中分别注入PRP 0.5 ml，最后逐层缝合伤口。放回原笼中饲养，自由活动。术后3 d内常规肌注青霉素40万U/d 预防感染。

5 实验干预 实验组术后在骨隧道内注入 1 ml RPP，同时于造模后第2天开始按骨碎补1 g/ml 剂量灌胃[6]，每只兔子使用4 ml制备药液，生理盐水稀释成10 ml 后灌胃给药，连续21 d。富血小板血浆组在骨隧道中注入1 ml RPP，骨碎补组于造模后第2天开始按骨碎补1.5 g/(kg·d)剂量灌胃，每只兔子使用4 ml制备药液，生理盐水稀释成10 ml 后灌胃给药，连续21 d。空白组则在术后不作任何特殊处理。

6 动物处死及取材

6.1 动物处死：分别在术后4、8、12周，每组随机以耳缘静脉空气栓塞法(20 ml空气)各处死6只兔子。

6.2 取材:外科操作完整取下手术侧胫骨和股骨，剔除周围皮肤肌肉和软组织，保留关节内外移植物，取下股骨-韧带-胫骨复合体。

7 实验观察 两组均随机取一半标本用生理盐水纱布包裹保存于-80℃冰箱，择期行生物力学测定。其余标本置入4 %的多聚甲酪溶液中固定，行Micro-CT扫描。

7.1 生物力学测定[7]：①检测前1 d将标本从-80℃冰箱，放于4℃冰箱过夜。②小心剔除膝关节中除重建的前交叉韧带之外的所有肌肉、软组织、韧带和缝线，避免影响生物力学检测。③恒温下(25℃，湿度65%)，用Zwick IZ010型万能材料测试机行生物力学检测，设置拉伸速度为5mm/min，量程100N。④将股骨-韧带-胫骨复合体置于生物力学测试仪中进行最大载荷拉伸试验，详细观察并记录将重建的前交叉韧带带从股骨或胫骨的骨隧道中拉出或将韧带带拉断的最大加载负荷，并计算其刚度。

7.2 Micro-CT扫描：两组取另一半标本，使用 Micro-CT(Sky Scan 1076，USA)进行扫描，扫描厚度为20μm，X线电压 80 kV，电流 312 μA 。所有标本均行三维CT重建，获取图像后用Data Viewer 与CT vox软件进行图像分析及重建，测量股骨骨隧道扩大宽度(即术后各时间点股骨骨隧道内口大小减去钻头直径2mm)大小(图3)。同时通过Micro-CT测定腱骨结合处骨组织的骨密度(BMD)(图4)。

结 果

术后10 d时实验组及骨碎补组分别有1个关节出现感染而致兔子死亡，去除死亡动物后予补充。

1 术后股骨骨隧道内口扩大宽度 在 ACL 重建术后4、8、12周各组比较可见：实验组股骨骨隧道内口扩大宽度均小于富血小板血浆组、骨碎补组、空白组，差异具有统计学意义(P均<0.05)；富血小板血浆组、骨碎补均小于空白组，差异具有统计学意义(P均<0.05)；富血小板血浆组各时间点隧道内口扩大宽度虽小于骨碎补组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2 骨密度(BMD)测定 术后4、8、12周，实验组腱骨结合处骨密度均较高于富血小板血浆组、骨碎补组、空白组，差异具有统计学意义(P均<0.05)；骨碎补组各时间点腱骨结合处骨密度高于富血小板血浆组和空白组，差异具有统计学意义(P均<0.05)；富血小板血浆组各时间点腱骨结合处骨密度高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 术后四组标本股骨骨隧道内口扩大宽度比较

组 别n4周骨隧道内口宽度8周骨隧道内口宽度12周骨隧道内口宽度实验组30.470±0.017*△▲0.413±0.015*△▲0.353±0.025*△▲富血小板血浆组30.553±0.040▲0.523±0.049▲0.460±0.044▲骨碎补组30. 600±0.030▲0.583±0.021▲0.530±0.035▲空白组30.657±0.0150.677±0.0210.617±0.021

注:与富血小板血浆组比较，*P<0．05；与骨碎补组比较，△P<0．05；与空白组比较，▲P<0．05

表2 术后四组标本骨密度(BMD)比较

注:与富血小板血浆组比较，*P<0．05；与骨碎补组比较，△P<0．05；与空白组比较，▲P<0．05。

3 生物力学测定 术后4、8、12周，实验组标本的最大加载负荷均高于富血小板血浆组、骨碎补组、空白组，除第4周加载负荷与富血小板血浆组相比，差异无统计学意义外，其余各组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。富血小板血浆组第4、8周加载负荷均高于骨碎补组，差异具有统计学意义(P<0.05)，第12周加载负荷小于骨碎补组，两组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；富血小板血浆组各时间点加载负荷均大于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)；骨碎补组第8、12周加载负荷大于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，第4周加载负荷虽高于空白组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组标本最大加载负荷比较

注:与富血小板血浆组比较，*P<0．05；与骨碎补组比较，△P<0．05；与空白组比较，▲P<0．05

讨论

现代药理学表明，骨碎补的主要要用成分为柚皮甙和总黄酮。柚皮甙有抗氧化作用，可促进成骨细胞，人骨髓间充质干细胞等成骨样细胞的增殖和分化[8]。其机制被认为是柚皮甙可下调成骨细胞中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，从而增强和促进成骨细胞骨形态发生蛋白2表达[9]。同时总黄酮可降低血液黏度，改善血液循环，起活血化瘀的作用，从而加快骨形成。杨丽等[10]通过观察骨碎补水提液对大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化能力及转化生长因子β1 (Transforming growth factor-β1 ，TGF-β1 )、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的影响，结果得出，骨碎补可促进TGF-β1 和BMP-2 的表达，而TGF-β1 和BMP-2均有调控间充质细胞增殖和分化的功能，可在成骨及骨基质合成中起重要作用。杨渊等[11]经体外实验也证明成骨细胞经柚皮甙诱导后，由于富含碱性磷酸酶，可合成I型胶原，形成钙化结节，促进MSCs的增殖和分化，加快成骨。

PRP含有大量生长因子及蛋白质，具有促进组织愈合和组织再生的功能，现在临床上已经广泛应用于骨关节炎[12]、软骨缺损、骨不连[13]、肱骨外上髁炎[14]、跟腱炎等各种疾病。因PRP含有大量的生长因子，可以诱导成骨且不引起自身的免疫反应，同时能促进肌肉组织和骨组织愈合及再生[15]。张健等[16]将兔子分为对照组和PRP组，将其前交叉韧带切断，同时取同侧自体半腱肌重建 ACL，对照组在骨隧道填充200 μl FG，而PRP组则在骨隧道填充 2 ml APRP + 200 μl FG，于术后 4、8、12周取实验标本，行HE 染色、VEGF 免疫组化。结果显示，术后4周对照组HE染色可见腱-骨处形成瘢痕组织，而同期PRP组则见肉芽组织，局部可见类软骨细胞；术后8周对照组可见腱-骨处形成相对成熟的瘢痕组织，同时出现密实的胶原纤维连接，同期PRP组已经出现成熟的软骨细胞；术后12周对照组见腱-骨连接处出现纤维软骨细胞，PRP组则见胶原纤维锚于骨质，同时可见较多的纤维软骨细胞，而且形态上，PRP组已接近正常ACL解剖结构，由此可见，ACL重建术后，生长因子在韧带的生长愈合过程中起重要作用。赵耀等[17]也发现，PRP复合小牛脱蛋白制成凝胶拥有良好的生物相容性，可诱导骨生长，促进ACL重建术后腱-骨的愈合。

由于内在坏境、营养、功能的特殊性，ACL的愈合能力非常有限。同时，ACL内含 Ⅰ 型胶原少，而 Ⅲ 型胶原含量较多，因此，其胶原交联程度较其他韧带高，当ACL在受到生长因子刺激后，细胞的前移，增殖，基质合成方面弱于其他韧带。韧带的愈合主要有胶原参与，而生长因子能提高胶原的表达及生成。本研究将中药骨碎补与PRP结合起来，用于ACL断裂的治疗，PRP中富含的血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促进移植物的血管再生，血小板类生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)可加速韧带的成熟，增强其抗拉能力。同时PRP中富含的生长因子以及骨碎补中的柚皮甙均可提高Ⅰ型胶原的表达及合成，对韧带的腱-骨愈合起积极作用。本实验结果也显示，骨碎补联合PRP组的骨隧道愈合情况、及肌腱的生物力学以及骨密度测定等指标均较PRP组好。因而，在PRP广泛运用于临床的时代，将传统中药骨碎补与PRP结合，可起到加快ACL重建后腱骨愈合、加强重建肌腱的韧性等作用。

可见，骨碎补联合PRP 可加促进兔腱骨愈合，加强重建肌腱的韧性。