响应面法优化虹鳟鱼骨中 可溶性钙提取工艺

杨淑晓,李 萌,马永生,赵前程,*,马 壮

(1.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023； 2.新疆赛湖渔业科技开发有限公司,新疆博乐 833400)

钙是人体中最丰富、最重要的矿物元素,在人体的正常生理代谢活动中具有极其重要的作用[1]。据我国膳食营养调查研究表明,在膳食营养素的摄入量中以钙的缺乏最为明显,供给量只有标准的50%[2]。钙摄入不足将严重威胁人体健康,会引起肌肉痉挛、骨质疏松以及佝偻病等症状,因此补钙已成为我国膳食中亟待解决的问题[3-4]。虹鳟(Oncorhynchusmykiss)作为联合国粮农组织向世界推广的四大淡水养殖品种之一的高档鱼,具有产量高、品质优良、营养丰富、人工养殖简便的优点[5]。1959年,我国首次从朝鲜引进虹鳟,自此开始进行虹鳟养殖及加工生产,并不断取得优异的经济效益[6],年生产能力可达3万吨[7]。但在其生产加工过程中,剩余了大量的副产物,包括鱼头、鱼骨、鱼鳞等,其中鱼骨占到鱼体的10%以上,利用率低造成大量资源浪费[8]。鱼骨中含有丰富的矿物质(Ca、P、Zn、Fe、Cr、Se、Mn等)等,其中钙磷比(1.53∶1)接近人体所需钙磷比例,益于人体吸收,是一种良好的天然钙资源,具有广阔的开发前景[9-11]。

鱼骨中的钙质溶解度低,极易饱和和析出,大多控制在羟基磷灰石结晶(HA)的形态,因此采用简单的物理方法(如常压煮制法等)不能将其有效的溶出。近年来,国内外学者研究鱼骨中可溶性钙的提取方法主要有:酸法、碱法和酶法。而酸法被认为是一种良好的提取钙的方法,具有提取率高,副作用小,成本低的优点[12-13]。

本研究以虹鳟鱼骨为原料,系统的考察了影响可溶性钙提取率的关键因子,利用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定骨中的钙,通过响应曲面法进行优化,确定最优的提取工艺。旨在为实现生产中对虹鳟鱼骨资源的研究和开发提供了一定的应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虹鳟鱼排 新疆赛湖渔业科技开发有限公司提供;浓盐酸 分析纯,大连博诺试剂有限公司;浓硝酸 优级纯,大连博诺试剂有限公司;钙离子标准贮备液 1000 μg/mL,北京世纪奥科生物技术有限公司。

FD-1型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;Stratos全能台式高速冷冻离心机 北京昊诺斯科技有限公司;盐度计 日本ATAGO株式会社;ICP-OES Optima 8000型电感耦合等离子体原子发射光谱仪 美国Perkin Elmer仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虹鳟鱼骨粉的制备 虹鳟鱼排经流水解冻后,除去杂质,切成段(2 cm×1 cm)。称取一定质量,加入木瓜蛋白酶(用量为底物的3%),料液比为7∶1 (mL/mg),温度45 ℃,水浴酶解3h,以消化脱除鱼排上的鱼肉,得到干净无污渍的鱼骨[14]。鱼骨经冷冻干燥机冻干(-62 ℃)后,将其粉碎成骨粉,过100目筛,超纯水洗至中性后二次冻干。

1.2.2 单因素实验 称取若干份1.000 g骨粉末,以钙提取率W为指标,固定料液比为1∶4 (g∶mL),探究盐酸浓度(mol/L)、提取时间(h)和提取温度(℃)对可溶性钙提取效果的影响[19]。选取盐酸浓度(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mol/L)为可变单因素,料液比为1∶4 (g∶mL),提取温度50 ℃,提取时间2 h;选取提取温度(30、40、50、60、70 ℃)为可变单因素,料液比为1∶4 (g∶mL),盐酸浓度3 mol/L,提取时间2 h;选取提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 h)为可变单因素,料液比为1∶4 (g∶mL),盐酸浓度3 mol/L,提取温度50 ℃。

1.2.3 响应面优化试验 由单因素实验结果,采用Box-Behnken中心组合试验模型,选择盐酸浓度、提取温度、提取时间三个因素进行响应面优化试验,其因素编码表如表1所示。

1.2.4 钙含量测定及可溶性钙提取率的计算

1.2.4.1 骨粉中总钙含量测定 参考GB 5009.92-2016湿法消解[15]。准确称取骨粉0.2 g,于已泡酸(15%～18%硝酸)过夜的石英瓶中,加入10 mL浓硝酸,于电热板上加热消解(约200～300 ℃)2～3 h。取下静置,待消化液冷却后,用高纯水定容至50 mL,混匀,0.22 μm过膜。利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测总钙的含量,同时做空白试验。

1.2.4.2 骨粉中可溶性钙含量测定 将所有的待测样品均在9000 r/min,4 ℃的条件下离心20 min后,取上清液用超纯水定容至50 mL,混匀,0.22 μm过膜,利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测可溶性钙的含量,同时做空白试验。

1.2.4.3 ICP-OES仪工作条件 参考GB 5009.268-2016所述操作条件(电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定部分)[16]。钙元素分析谱线波长:317.933 nm;观测方式;Radial观测模式;功率:1300 W;等离子气流量:12.0 L/min;辅助气(Aux)流量:0.2 L/min;雾化气体(Neb)流量:0.55 L/min;分析泵速:30 r/min

1.2.4.4 钙标准曲线的绘制 参考GB 5009.92-2016进行绘制(电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定部分)[15]。精确吸取一定体积钙离子标准贮备液于试管中,用0.5%硝酸溶液逐级稀释,配制成一定质量浓度梯度(0、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40 mg/L)的钙标准工作液,利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪,测定钙离子分析谱线的信号强度值。横坐标设定为钙离子标准液的浓度,纵坐标设定为信号强度值,绘制标准曲线为:

y=73327.677x+4702.828R2=0.9998

式(1)

1.2.4.5 钙含量的测定

式(2)

式中:N为钙含量,mg/g;C1为样品中钙的质量浓度,mg/L;C0为空白样中钙的质量浓度,mg/L;V为样品定容体积,mL;f为稀释倍数;m为样品质量,g[17-18]。

1.2.4.6 可溶性钙提取率的计算

式(3)

式中:W为可溶性钙提取率,%;N2为骨粉中可溶性钙的含量,mg/g;N1为骨粉中总钙的含量,mg/g。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 骨粉中可溶性钙单因素实验

2.1.1 盐酸浓度对钙提取率的影响 由图1可知,盐酸浓度为1.5～3.0 mol/L时可显著增加骨粉中可溶性钙的提取率(p<0.05)。浓度取值3.0 mol/L时,可溶性钙提取率最高。此后增大盐酸浓度,钙提取率差异不显著(p>0.05),逐渐趋于平衡(饱和)状态。因此得出最适盐酸浓度为3.0 mol/L。

图1 盐酸浓度对钙提取率的影响Fig.1 Effect of the concentration of hydrochloric acid on the extraction rate of calcium注：图中不同字母表示差异性显著(p<0.05)； 相同字母为差异不显著(p>0.05)；图2、图3同。

2.1.2 提取温度对钙提取率的影响 温度影响反应体系中盐酸分子的运动速率[20]。由图2可看出,在30～50 ℃的区间内,升高温度,骨粉中可溶性钙的提取率增大(p<0.05),温度升高到50 ℃时,钙的提取率达到最大。继续增高温度至70 ℃,相比与60 ℃,钙提取率会显著下降(p<0.05)。这可能是由于盐酸是强挥发性酸,钙离子的溶出和盐酸挥发两个反应系统是相互独立的,温度升高,盐酸分子的运动速率加快,挥发出大量盐酸,使其实际浓度降低,影响可溶性钙的提取。因此得出提取的最适温度为50 ℃。

图2 提取温度对钙提取率的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature on the extraction rate of calcium

2.1.3 提取时间对钙提取率的影响 由图3得出,提取时间在1.0～2.0 h时,骨粉中可溶性钙的提取率随时间的延长而增大。反应时间为2.0 h时,钙提取率达最高值,随着酸解时间的继续增加(2.5～4.0 h),钙提取率变化不显著,而当提取时间达5.0 h时,与4.0 h相比,可溶性钙的提取率呈略微下降(p<0.05)。这可能是在进行反应的同时,盐酸不断的挥发出,导致反应系统中盐酸的实际浓度下降,不利于可溶性钙的提取。因此得出提取的最佳时间为2.0 h。

图3 提取时间对钙提取率的影响Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction rate of calcium

2.2 响应面优化试验结果分析

表2列出了盐酸进行酸解提取虹鳟鱼骨可溶性钙的设计方案及结果。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface design of results

利用Design Expert 8.0.5设计软件对表2中的数据进行多元回归拟合,得出二次多项回归模型:

W(%)=28.28+0.93A-0.26B+0.19C+0.28AB+1.18AC+1.28BC-0.70A2-0.78B2-3.43C2

表3 响应面试验方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

方差分析表中一次项A,交互项AC、BC及二次项C2对响应值钙提取率的影响达到极显著水平(p<0.01);二次项A2、B2达到显著水平(p<0.05);一次项B、C及交互项AB则对响应值W影响不显著(p>0.05),说明各试验因素对响应值钙提取率的影响不仅是呈现浅易的线性关系[23]。由以上推出,各因素对响应值钙提取率的影响主效应顺序为A>B>C,即盐酸浓度对可溶性钙的提取率影响最大,其次是提取温度,提取时间则对响应值钙提取率的影响最小。

2.3 响应曲面及等高线分析结果

基于该模型的多元二次线性回归方程绘制各因子与响应值W对应的响应曲面和等高线图,以进一步考察A、B、C三因素两两之间的交互作用对可溶性钙提取率的影响,结果如图4～图6。响应曲面的走势及坡度可体现试验因素对响应值的影响,曲面走势越陡峭,表明两因素交互效应对响应值的影响越显著,钙提取率的改变越敏感;走势越平缓则与之相反。等高线的形状及疏密程度可表示出两因素互作效应的强弱,椭圆形且曲线密集体现其互作效应对响应值的影响显著,若圆形、曲线稀疏则影响不显著[24-25]。

图4 盐酸浓度和提取温度交互作用对钙提取率的影响Fig.4 Hydrochloric acid concentration and extraction temperature interaction to calcium in the influence of extraction

图5 盐酸浓度和提取时间交互作用对钙提取率的影响Fig.5 Hydrochloric acid concentration and extraction time interaction to calcium in the influence of extraction

图6 提取温度和提取时间交互作用对钙提取率的影响Fig.6 Extraction temperature and extraction time interaction to calcium in the influence of extraction

如图4～图6可知,盐酸浓度和提取温度的互作效应对响应值W的影响不显著;盐酸浓度和提取时间的互作效应对响应值W的影响极显著(p<0.01);提取温度和提取时间的互作效应对响应值W的影响极显著(p<0.01)。

以上每一对变量的交互效果表明,在提取可溶性钙时,随着盐酸浓度、提取温度及提取时间的增加,钙提取率也趋向一个特定水平(最大值),高于该水平后,钙提取率略微下降。可能是由于在较高盐酸浓度、提取温度和提取时间的条件下,盐酸表现出较强的挥发性,促使盐酸分子的运动速率加快,挥发出大量盐酸,使其实际浓度降低,从而影响钙的提取。

经研究,响应曲面若为开口向下的凸形曲线,且居于高、低水平之间存在最高点,说明响应指标值在所设定的自变量水平范围内存在极大值,即此值为响应曲面的最高点,同样也代表等高线中最小椭圆的中心点[26]。如图5、图6响应曲面均开口向下,走势陡峭,等高线呈椭圆形且曲线较密集,结合表3，表明盐酸浓度与提取时间、提取温度和提取时间的交互效应影响极显著(p<0.01);而图4响应面接近于平面,等高线呈圆形且曲线稀疏,说明盐酸浓度与提取温度的交互效应影响不显著,与方差分析的结果一致。

2.4 最佳工艺参数确定及验证性试验

通过软件分析可知,盐酸浸提虹鳟鱼骨中可溶性钙的最佳工艺条件为:盐酸浓度3.44 mol/L,提取温度51.60 ℃,提取时间2.10 h,在此优化条件下,可溶性钙提取率可达28.68%。考虑实际操作的局限性及实用性,将最佳工艺最终修正为盐酸浓度3.4 mol/L,提取温度52 ℃,提取时间2.1 h。在此工艺条件下重复试验三次,取平均值得钙提取率为28.45%,与理论值相差0.23%,表明此回归模型具有可靠性[27-28]。

3 结论

本试验采用酸法提取虹鳟鱼骨中可溶性钙,用电感耦合等离子发射光谱法测定骨中钙的含量,通过响应曲面分析确定单个因素的主效应顺序为:盐酸浓度>提取温度>提取时间。经二次多项回归模型确定最佳提取条件为盐酸浓度3.4 mol/L,提取时间2.1 h,提取温度52 ℃,此工艺下可溶性钙提取率为28.45%,与预测理论值误差小,说明此模型具有实际可操作性,为现实中综合利用虹鳟鱼骨资源提供了参考价值。