乳酸菌细菌素的抑菌活性测定 及效价表示方法

孙思睿,万 峰,贺 菁,张 晟,孟祥晨

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

乳酸菌在代谢过程中会产生多种抑菌物质,如细菌素、有机酸、过氧化氢等,其中细菌素以其优良的性能被广泛用于食品、医药等各个行业。随着人们生活水平的提高,健康安全已经成为食品生产的必然趋势,细菌素可以有效地代替食品中化学防腐剂控制病原微生物的生长[1],一定程度上降低了化学添加剂对人体的不良影响,逐渐成为研究的热点[2]。虽然目前商品化产品仅限于乳酸链球菌素Nisin和片球菌素pediocin等有限几种,但迄今为止,研究者已经发现1700多种细菌素,其中300余种为乳酸菌细菌素[3]。

目前,许多国家对Nisin在食品中的添加量已有明确限制,实验表明人体安全摄入量应低于2.9 mg/人/日[4]。同时研究者也在不断发掘更多安全且抑菌活性较强的细菌素,以助于更好的应用于生产实践,因此对细菌素抑菌活性的准确检测及结果的规范性表示显得尤为重要。目前主要采用的检测方法为琼脂扩散法和临界稀释法,但对细菌素效价的表示暂无统一标准,因此本文旨在比较几种常见的细菌素抑菌活性的测定方法,同时试图给出细菌素抑菌活性结果准确表示的通用方式。

1 乳酸菌细菌素

细菌素是核糖体在微生物生长代谢过程中产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽,当达到一定数量时可以杀死或抑制某些微生物[5],因此可以有效地抑制食物中食源性微生物及某些腐败菌的生长,起到生物防腐作用。

乳酸菌细菌素有多种分类方式,通常被分为三类:分别是羊毛硫细菌素、非羊毛硫抗生素和溶菌素[6]。细菌素通常在乳酸菌培养至对数生长末期或稳定期前期[7]时产生,它们都通过非特异地吸附到细胞膜表面,使其形成孔洞后释放水合氢离子和ATP,使质子动力(PFM)丧失[8],当细菌素浓度达到一定阈值时会破坏细胞结构,从而产生抑菌作用;但能否与细胞进行特异性结合,还要取决于细胞壁和细胞质膜的结构。几种研究较为深入的乳酸菌细菌素如表1所示。虽然细菌素具有一定的抑菌活性,但并不意味着在任何条件下都能够发挥应有的效应,这不仅取决于细菌素自身的特性,还取决于对样品处理的方式以及产细菌素菌株的培养环境等。此外,细菌素在应用过程中也可能面临着溶解度较低,易被一些蛋白酶类食物组分降解等风险,以及产量小纯度较低需要经过复杂的纯化后才能应用于实际生产等劣势[9],因此在一定的条件下准确测定其抑菌活性以及保证其能发挥应有的效力显得尤为重要。

表1 当前研究较深入的乳酸菌细菌素Table 1 The current study on bacteriocins secreted by Lactic acid bacteria

2 含细菌素无细胞发酵上清液的制备

微生物培养物经处理后制备成无细胞发酵上清液后才能够用于测定细菌素抑菌活性,主要包括:离心、中和、添加过氧化氢酶除去H2O2等其他抗菌物质的干扰[29]。

培养物在离心处理前应考虑该菌所产细菌素是仅存在于上清液中,还是会一定程度地吸附于菌体细胞上,以此为依据来判断是否仅进行简单的离心操作来制备无细胞发酵上清液。Gong等[30]对细菌素plantarumMG进行pH和温度耐受性实验,结果表明该细菌素在pH2.00～10.00的范围内均保持较好的抑菌活性,且在121 ℃下加热30 min后,抑菌活性也并未降低。但是由于细菌素自身的性质不同,为提高抑菌活性检测的准确度,应探究清楚细菌素本身对pH、温度以及其它营养组分等环境因素的耐受能力,以免在后续处理过程中活性下降影响测定结果。有研究怀疑将培养物透过0.22 μm滤膜可能会影响细菌素的抑菌活性[31],但是Van[32]成功地将大肠杆菌素E2-P9(0)通过该孔径滤膜而并未损失抑菌活性,因此在现今的实验中仍然采用滤膜过滤的方式除菌,暂时忽略其可能产生的影响。

某些菌株所产细菌素的浓度较低不利于后续检测,可以采用浓缩方法,或将其纯化后再进行测定。样品通常要低温保藏,且注意保藏时间和避免反复冻融,有实验称反复冻融三次后细菌素效价会有所下降[33]。Bifidodacteriumspp. 在-20 ℃或-70 ℃下贮藏1～3个月,其效价便由原来的51200 AU/mL降至30000 AU/mL,而当贮存于-4 ℃时,抑菌活性则降至原来的75%[34]。

3 细菌素抑菌活性测定方法

3.1 琼脂扩散法(AWDA,Agar well diffusion assay)

起初采用临界稀释法测定细菌素的抑菌活性,但鉴于琼脂扩散法在检测抗生素活性上有很好的应用,所以在Tramer等[35]提出将该方法应用于细菌素抑菌活性的检测。根据媒介不同,又可将其分为牛津杯法、双层平板打孔法和滤纸片法等。

很多因素会影响抑菌活性测定结果,如指示菌的数量、培养时间、扩散时间和温度以及上样量等,因此该方法也在不断地被完善。培养基中琼脂含量会影响细菌素的扩散速度,通常含量越高扩散速度越慢,但为保证其凝固效果,也不能一味的降低培养基中琼脂的量。Wolf和Gibbons[36]发现当琼脂质量浓度为7.5 g/L有助于细菌素的扩散;同时添加一定量的缓冲溶液可以有效缓解低pH对抑菌效果造成的影响。国标GB1886.231-2016[37]在检测Nisin活性时,向培养基中加入一种表面活性剂吐温20,促进细菌素的扩散,扩散的越完全会使得其测定的抑菌活性更准确。检测Nisin抑菌活性时发现,将上样后的平板置于4 ℃下扩散,既不会使指示菌生长,又能提高检测准确度,Lalpuria等[38]基于上述研究后发现,孔径为7 mm抑菌圈直径大于孔径为3 mm时,但孔径较小时精度更高;同时对最佳扩散时长进行建模发现,总体而言,扩散48 h后测定结果准确度最高。由于不同细菌素其自身特性的不同,导致其分离及测定参数不能一概而论,应根据每一个步骤中面临的实际问题,来确定最终的测定方法。

3.2 临界稀释法(CDA,Critical dilution assay)

临界稀释法可以分为试管稀释法(TDA,Tube dilution assay)、96孔板法以及浊度法(TA,Turbidometric assay)等,其本质均为半定量测定[39]。临界稀释法是将待测样品梯度稀释,再以一定量加入到含指示菌的培养基中,通过测定吸光值或指示菌活菌数的变化,最终确定对指示菌生长的抑制率。但需要注意的是,含细菌素的粗提液中含有一定的营养成分,可能会为指示菌的生长提供额外的营养,为了排除此影响,可以将样品透析,剔除小分子营养物质,尽可能保证实验的准确性。临界稀释法与琼脂扩散法的区别见表2所示。

表2 细菌素抑菌活性测定方法比较Table 2 A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity

3.3 其他检测方法

3.3.1 ELISA测定细菌素抑菌活性 ELISA检测是将已知量的Nisin溶液涂层于孔板中,添加过量未标记的抗体共同孵育一定时间后,洗去未结合抗体,加入酶标记抗体,最后添加底物显示荧光信号。Chollet等[40]测定食品基质中脂肪对细菌素扩散效率的影响时将Nisin与抗血清进行竞争性免疫测定,用已知浓度的乳链菌肽制备内容物,通过反扩散将Nisin从不同脂肪含量的琼脂糖凝胶中提取并测量。采用ELISA方法检测出Nisin扩散时间与扩散深度的回归方程并建立模型,较为准确的检测凝胶中Nisin的免疫活性。ELISA相对于观察抑菌圈的大小来说更加的准确和敏感,它通常应用于建立细菌素的扩散效率模型,从而对细菌素进行定量检测。

3.3.2 ATP生物荧光法测定细菌素抑菌活性 细胞内含有大量的ATP,可与荧光素发生反应,Nina等[41]开发了一种基于生物发光传感器检测食品中超低量乳酸菌肽的方法,他们将细菌萤光素酶操纵子luxABCDE置于质粒pNZ8048中的nisA启动子的控制下,并转化到两株乳酸乳球菌中。这些菌株的nisRK基因使其感受乳链菌肽并传递信号,起始nisA启动子转录。由于构建的乳酸链球菌素生物传感器菌株NZ9000lux和NZ9800lux经乳酸链球菌素诱导后发光,且信号量随乳酸链球菌素含量的增加而增加,因此可以通过发光强度来检测Nisin的含量。在细菌素的检测上,该技术不需要添加额外的外源底物,利用传感器直接通过实时成像系统检测生物发光情况,操作简单且费时较短,对于不透明或是指示剂难于选择的样品有很好的应用;但易受到游离ATP的干扰,以及反应体系的最佳条件难以摸索[42]。

除此之外,抑菌活性的测定还可以采用毛细管电泳、电导测定以及辐射法等。相比于常规实验室方法而言,这些方法由于相对成本较高且具有一定特异性,目前暂未在实验中得到广泛应用。但是仪器操作使得结果更加准确高效,且重复性更高。这些研究的推进也表明:迫切需要建立一种高效便捷的细菌素抑菌活性的测定方法。

4 细菌素效价的表示方法

通常以三种形式表示细菌素的效价:即国际单位IU/mL、任意单位AU/mL以及细菌素效价自定义单位BU/mL。

4.1 以Nisin为基准定义细菌素效价

由于Nisin效价已被定义为106IU/g,因此可以以抑菌圈直径或生长抑制率为纵坐标,以Nisin的不同稀释浓度对应的效价值作为横坐标绘制标准曲线。Delgado等[43]测定四株乳酸菌所产细菌素的抑菌活性,以Nisin为对照,将测定结果直接带入标准曲线来计算待测细菌素的效价。此外,赖文等[44]在测定戊糖乳杆菌B8产细菌素动力模型时,也采用该方式以Nisin作为基准确定待测细菌素效价。据此刘国荣等[45]将纯化后的细菌素BB04的效价定义为640 IU/mL。

由于Nisin只有在一定浓度范围内才呈线性关系,而浓度的确定与指示菌的选择密不可分。Papagianni等人[46]以不同的菌株作为指示菌,发现无论采用何种抑菌活性测定方法,在较低的Nisin浓度下,只有对L.curvatusATCC51436和P.acidilacticiATCC25740的抑制率才与浓度呈线性关系,而对L. sakei的抑制率在Nisin活性为40～1000 IU/mL范围时才呈良好线性关系(见图1)。

4.2 临界稀释法以AU/mL为单位定义细菌素效价

在目前的研究性试验中,细菌素效价最常用的表达方法为AU/mL,且采用该定义方法时通常采用琼脂扩散法。1 AU/mL被定义为能够产生明显抑菌圈的最高稀释度的倒数[47-48]。目前得到最广泛的认可。效价的计算过程简述如下。先简单的进行系列梯度稀释,以稀释过程中能出现明显抑菌圈的稀释度记为稀释因子D,而每孔中的浓度:

通过计算:

根据各个不同稀释度所对应抑菌圈的大小绘制标准曲线R=a+blog(d)(式中：R代表抑菌圈直径mm或抑菌圈面积mm2),可以分别得出斜率b与截距a的值。则细菌素效价[49]:

本实验室依据此方法测定植物乳杆菌1.0391在37 ℃培养20 h时所产的细菌素效价,得到标准曲线R=9.1885x+4.4431(R2=0.9956)。

4.3 以BU/mL为单位定义细菌素效价

用浊度法测定细菌素活性时常采用BU/mL表示细菌素效价。指示菌的生长抑制率定义为I:

式中:A1为一定量细菌素与指示菌混合液的吸光值,A0为对照组,即等量无菌水与指示菌混合液的吸光值。

通过测定连续的稀释浓度,找寻ID50即一半抑制浓度即(I=0.5),并将此浓度定义为1 BU/mL[50],通过稀释度的倒数绘制反曲线方程,计算待测细菌素的效价。三种细菌素效价表示方法的优缺点如表3所示。

表3 细菌素效价表示方法的比较Table 3 A comparison of the representation of bacteriocin titer

5 结论与展望

虽然琼脂扩散法操作复杂且受到很多因素影响,但仍然是抑菌活性测定的主流方法。然而随着研究的逐步推进,廉价实用的试剂盒以及更精准的实验仪器必将替代手动方式作为高效的检测手段。目前人们已经基于Nisin,对影响抑菌活性测定的pH、扩散温度及时间、处理方式等一系列相关因素进行了较为详尽的研究,期望最大限度地优化测定方法,以减小实验误差,也获得了一定成效。此外,目前主要采用AU/mL和IU/mL两种表示方法定义细菌素效价,而任意单位AU在国际范围内的应用更为广泛,也得到大多数学者的认可;但由于其是以自身抑菌能力为标准,虽然在实验中可以通过比较而得出对比结果,但是若比较两种或多种不同的细菌素的抑菌活性时,同样存在诸多不便。因此,在未来的研究中首先应尽量创造合适的生产环境来保证乳酸菌细菌素的活性;其次,仍需要找寻一种改良或替代琼脂扩散法的方法,以便提高细菌素抑菌活性测定的准确性,更好的挖掘抑菌活性较强的生物防腐剂;此外还应探索建立应用更加广泛且具有高认可度的细菌素效价表示方法。相信随着科技的发展以及研究的进一步完善,更多的乳酸菌细菌素将被合法使用,乳酸菌细菌素将会广泛地应用到食品防腐、疾病治疗等更多领域。