云南产黄皮疣柄牛肝菌基本营养成分 和抗氧化活性

刘秋鸣,李 笑,肖俊江,孙丽平

(昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

黄皮疣柄牛肝菌(Leccinellumcrocipodium),又称黄癞头,属真菌界(Fungi),担子菌门(Basidiomycota),伞菌纲(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),疣柄牛肝菌属(Leccinellum),在松、落叶栎类林地上群生或单生,属于外生菌根菌[1]。在我国江苏、安徽、福建、贵州、台湾等地均有分布,在云南省,常见于除西双版纳等热带地区之外的市场[2]。

黄皮疣柄牛肝菌味道鲜美、营养丰富,含蛋白质、总糖、脂肪、氨基酸等营养成分及多种矿质元素[3-4]。食用菌多酚被发现具有一定抗氧化活性[5]。王婷婷等[6]研究了黄皮疣柄牛肝菌、马勃菌、黑牛肝菌、鸡枞4种野生菌的多酚含量及活性,发现黄皮疣柄牛肝菌中多酚含量最高,抗氧化活性最好。刘雨阳等[7]研究发现黄皮疣柄牛肝菌多酚提取物对Caco-2结肠癌细胞具有一定程度的抑制作用。

本研究采集了云南省主要产区25个位点的黄皮疣柄牛肝菌样本,测定了子实体的基本营养成分,分析了子实体多酚粗提物中多酚含量与其DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、铁离子还原能力和金属螯合能力的相关性,探讨了云南各产地的黄皮疣柄牛肝菌子实体的营养性与功能性。本研究采样范围广,研究结果具有一定代表性,能为消费者、食品制造商以及食品研究人员提供科学信息,为黄皮疣柄牛肝菌的综合利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄皮疣柄牛肝菌 采集时间和地点如表1所示,样品采集当天带回实验室,削除表面不可食部分,先后用流动水和超纯水清洗,冷冻干燥,研磨粉碎,过40目绢筛,于棕色抽真空的干燥器中储存,待测;1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基(DPPH·)、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、EDTA、Ferrozine(菲洛嗪) 美国Sigma公司;其它试剂 均为分析纯。

表1 样品采集地点和时间Table 1 Collecting location and time of sample

Alpha 1-2/LD型冷冻干燥机 德国CHRIST;DL-5-B型低速大容量多管离心机、TGL-20B型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;UV-6100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;SB5200D型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-2型恒温水浴锅 金坛市瑞尔电器有限公司;SX-4-10型马弗炉 长沙市华光电炉厂;SZF-06A型脂肪测定仪 上海新嘉电子有限公司;DHG9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本营养成分测定 粗蛋白含量测定依据GB 5009.5-2010,采用凯氏定氮法。粗脂肪含量测定依据GB/T 5009.6-2003,采用索氏抽提法。粗灰分含量测定依据GB 5009.4-2010,采用灼烧法。可溶性总糖含量测定采用苯酚硫酸法。以上结果均表达为%干重(DW)。

1.2.2 多酚提取 准确称取1.0 g样品于50 mL离心管中,加入15 mL 70%甲醇,连续超声辅助提取1 h,输出功率200 W。5000 r/min离心10 min,收集上清液。向沉淀中加入10 mL 70%甲醇重复提取步骤,合并上清液,并用70%甲醇定容至25 mL,得样品多酚粗提液,储存于4 ℃待测。

1.2.3 多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]测定多酚含量。标准曲线的绘制:准确吸取0.5 mL 0、20、40、60、80、100 μg/mL没食子酸的标准工作液于10 mL连盖离心管中,加2.5 mL 10%福林酚试剂,摇匀,静置5 min,加2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液,摇匀,室温下避光反应60 min,于765 nm下测定吸光值,以吸光值和标准工作液浓度为坐标建立曲线。以0.5 mL多酚粗提液代替没食子酸标准工作液,按照上述方法测定吸光值,计算黄皮疣柄牛肝菌多酚含量,结果表达为mg没食子酸当量/g干样(mg GAE/g DW)。

1.2.4 DPPH·清除能力测定 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液配制:精确称取DPPH 0.1972 g,溶于甲醇,定容至500 mL,配制成1 mmol/L DPPH甲醇母液,取DPPH甲醇母液用甲醇稀释10倍即得0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液。

DPPH·清除能力测定采用文献[9]的方法。取0.4 mL粗多酚提取液,加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液,混匀,室温避光反应30 min,于517 nm下测定吸光值。Trolox作阳性对照,以20～100 μmol/L浓度的Trolox DPPH·清除能力做标准曲线。样品DPPH·清除能力结果表示为Trolox当量(μmole TE/g DW)。

1.2.5 ABTS+·清除能力测定 ABTS+·清除能力参考文献[10]方法测定,稍作修改。取5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液与88 μL过硫酸钾(40 mmol/L)的混合,于室温黑暗中放置12 h,制备ABTS+·储备液。该储备液用70%乙醇稀释至734 nm下吸光值为0.70±0.02,得ABTS+·工作液。取4 mL ABTS+·工作液与0.5 mL多酚粗提液混合,于30 ℃水浴条件下反应6 min,于734 nm下测定吸光值。70%甲醇代替样品做空白对照。Trolox作阳性对照,以20～100 μmol/L浓度的Trolox ABTS+·清除能力做标准曲线。样品ABTS+·清除能力测定结果表示为Trolox当量(μmole TE/g DW)。

1.2.6 铁离子还原能力(FRAP)测定 采用文献[11]的方法,稍作修改。标准曲线:将0.3 mol/L的醋酸缓冲液(pH3.6)、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例配制成FRAP工作液。取浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液各150 μL,分别加入4.5 mL FRAP试剂,混匀后37 ℃水浴条件下反应10 min,测定593 nm处吸光值,以FeSO4·7H2O浓度和吸光值绘制标准曲线。

样品测定:4.5 mL FRAP工作液与150 μL多酚粗提液混合,混匀后37 ℃水浴条件下反应10 min,于593 nm处测定吸光值。70%甲醇代替样品做空白对照。样品铁离子还原能力(FRAP值)以每100克干质量样品达到同样吸光度所需FeSO4毫摩尔数表示(mmole Fe2+E/100 g)。

1.2.7 金属螯合能力测定 Fe2+螯合能力测定参考文献[9]方法测定。1 mL多酚粗提液与3.7 mL超纯水混合,加入100 μL 2 mmol/L FeCl2,混合30 s,再加入200 μL 5 mmol/L菲洛嗪,混匀,室温静置10 min,于562 nm处测定吸光值。70%甲醇代替样品做空白对照。EDTA做阳性对照,以0.034～0.171 mmol/L的EDTA Fe2+螯合能力做标准曲线。样品Fe2+螯合能力测定结果表示为EDTA当量(μmole EDTA E/g)。

1.3 数据统计

2 结果与分析

2.1 菌体基本成分和总酚含量

黄皮疣柄牛肝菌子实体的基本成分测定结果如表2所示。不同产地黄皮疣柄牛肝菌粗蛋白含量为24.54% DW±0.33% DW～37.25% DW±0.71% DW,29号样品陆良的粗蛋白含量最高,为37.25% DW±0.71% DW,29个样本粗蛋白含量均值为29.55%,高于野生菌中美味牛肝菌、铜色牛肝菌和网柄牛肝菌以及常见栽培食用菌中的平菇、金针菇等[12]食用菌子实体的粗蛋白含量。食用菌的总糖含量是其营养和质量评价的重要指标之一,包括水溶性多糖、寡糖和单糖。食用菌中的多糖具有比较复杂而全面的生理活性和功能[13-14]。本研究中不同产地黄皮疣柄牛肝菌子实体的可溶性总糖含量为7.03% DW±0.30% DW～19.03% DW±0.03% DW,低于一些常见食用菌[15]香菇(32.4%)、平菇(22.25%)、金针菇(47.89%)等。粗脂肪含量相对较低的5个样本为宁洱(0.88% DW±0.37% DW)、花山3(1.30% DW±0.16% DW)、江川(1.51% DW±0.04% DW)、墨江(1.59% DW±0.06% DW)和峨山(1.67% DW±0.27% DW),其它24个样本中脂肪含量为1.85% DW±0.12% DW～3.78%±0.03% DW,均值为2.83%,与梅文泉等[3]测定黄皮疣柄牛肝菌营养成分分析比较,脂肪含量略高。不同产地黄皮疣柄牛肝菌粗灰分含量4.31% DW±0.02% DW～7.07% DW±0.04% DW,低于Barros等[16]测定的几种食用菌(7.07%～16.48%)。从表2可以看出,不同产地和采集时间的黄皮疣柄牛肝菌子实体的基本营养成分含量存在显著性差异(p<0.05),这可能是因为生长环境的不同,采集时间的差异,但总体上有高蛋白低脂肪、含有一定量可溶性总糖的特点。

表2 黄皮疣柄牛肝菌基本营养成分和总酚含量Table 2 Proximate composition and polyphenols contents of Leccinum crocipodium

真菌类食物可提供给人体具有多重生物活性的多酚类物质,多酚类物质具有活泼的多羟基结构,从而具有较强的供电子能力,使其成为有效的抗氧化活性成分[17]。本研究提取黄皮疣柄牛肝菌总酚并测定其含量,结果如表2所示,不同产地黄皮疣柄牛肝菌总酚含量为(12.25±0.67)～(24.44±0.72) mg GAE/g DW,相对较高的6个样本为宜良(24.44±0.72) mg GAE/g DW、陆良(23.83±0.06) mg GAE/g DW、峨山(23.61±0.69) mg GAE/g DW、砚山(20.27±0.14) mg GAE/g DW、建水(20.11±0.03) mg GAE/g DW和通海(20.08±0.42) mg GAE/g DW,最低为禄丰(12.25±0.67) mg GAE/g DW。本研究黄皮疣柄牛肝菌总酚含量略高于侯文井等[18]报道的美味牛肝菌、元蘑、榛蘑和黑木耳中总酚含量,说明黄皮疣柄牛肝菌是一种多酚含量丰富的野生食用菌。

2.2 粗多酚提取物的抗氧化性分析

DPPH·清除能力被广泛用于评价多酚的抗氧化能力以及天然抗氧化剂的筛选。如表3所示,不同产地黄皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有一定DPPH·清除能力。普洱(2.38±0.03) μmole TE/g、宜良(2.56±0.02) μmole TE/g、宁洱(2.58±0.01) μmole TE/g 3个样本的DPPH·清除能力相对较低,其均值为2.51 μmole TE/g。其它26个样本的DPPH·清除能力为(2.77±0.07)～(3.39±0.01) μmole TE/g,均值为3.20 μmole TE/g,高出相对较低的3个样本均值(2.51 μmole TE/g)的127%。抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用是由于其供氢能力,蘑菇提取物的抗氧化活性可能是多酚类物质中的羟基作用,蘑菇粗多酚可能是天然抗氧化剂的潜在来源。

表3 黄皮疣柄牛肝菌粗多酚提取物的抗氧化能力和金属螯合能力Table 3 Antioxidant activities and metal chelating ability of Leccinum crocipodium

ABTS不仅是亲水型化合物还是亲脂型化合物,比较容易反应。ABTS+·的清除是电子转移过程,体系中的抗氧化剂与其反应将会使溶液褪色,表现为吸光值的降低[19],从而反映出试样抗氧化能力的大小。不同产地黄皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有很好的ABTS+·清除能力,且存在显著性差异(p<0.05)。ABTS+·清除能力范围为(1.85±0.01)～(3.00±0.05) μmole TE/g,相对较高的5个样本为花山4(3.00±0.05) μmole TE/g、东川(2.97±0.01) μmole TE/g、花山2(2.83±0.02) μmole TE/g、开远(2.77±0.01) μmole TE/g和丘北(2.76±0.01) μmole TE/g,均值为2.87 μmole TE/g,高出其它剩余24个地区均值(2.31 μmole TE/g)的124%。

FRAP还原能力为抗氧化剂将Fe3+还原为Fe2+,Fe2+与TPTZ结合生成蓝色络合物,该络合物在波长593 nm处有最大吸收。吸光度越大,表明抗氧化剂的还原能力越强,也就是有更高的抗氧化活性[20]。不同样本黄皮疣柄牛肝菌多酚粗提物均表现较高的FRAP还原能力,相对较高的3个样本为峨山、寻甸、花山4,其FRAP值分别(1.74±0.03)、(1.60±0.02)、(1.46±0.02) mmole Fe2+E/100 g,均值为1.6 mmole Fe2+E/100 g,相对较低的4个地区为宁洱(0.74±0.01 mmole Fe2+E/100 g)、石林(0.85±0.02 mmole Fe2+E/100 g)、沾益(0.90±0.00 mmole Fe2+E/100 g)和嵩明(0.95±0.03 mmole Fe2+E/100 g)。其它22个地区的FRAP还原能力为0.97～1.36 mmole Fe2+E/100 g,均值为1.06 mmole Fe2+E/100 g。FRAP还原能力相对较高的前3个地区的均值高出其它剩余22个地区均值的151%。

Ozgen等[21]研究认为DPPH、ABTS和FRAP抗氧化评价模型简单、稳定、极易操作,反应机制上,DPPH、ABTS和FRAP均评价了抗氧化物质的单电子转移能力,但是其反应体系极性不同,为了综合评价天然抗氧化物的抗氧化活性,需要多模型的抗氧化评价体系,DPPH、ABTS和FRAP三个体系的联合应用是合适的。

适量的铁对于细胞功能有重要作用,例如氧运输、细胞呼吸和许多铁金属酶的辅因子,而过量的游离铁会导致Fenton反应产生活性氧物质[22],因此金属离子螯合可以一定程度上降低金属离子的催化作用,避免自由基的生成,这也是一种评价试样抗氧化性能常用的方法。不同样本黄皮疣柄牛肝菌多酚粗提物具有很好的Fe2+螯合能力,且存在一定的显著性差异(p<0.05),相对较高的为禄丰(3.29±0.03) μmole EDTA E/g、花山3(3.27±0.03) μmole EDTA E/g、江川(3.06±0.01) μmole EDTA E/g、峨山(3.04±0.00) μmole EDTA E/g、丘北(3.03±0.03) μmole EDTA E/g,这5个地区Fe2+螯合能力均值为3.14 μmole EDTA E/g,高出其它剩余22个地区均值(2.25 μmole EDTA E/g)的140%。

2.3 抗氧化活性与总酚含量相关性分析

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力是基于分光光度法,通过测定样品清除自由基的能力来表征其抗氧化能力。FRAP法反映的是样品还原Fe3+的能力,MCA法则测定样品螯合Fe2+的能力。植物抗氧化能力与其多酚、黄酮类、VC、VE和类胡萝卜素等物质含量有一定的相关性[23]。不同评价体系下黄皮疣柄牛肝菌抗氧化活性与总酚含量相关性分析如表4所示。总酚含量(TPC)与ABTS+·清除活性和FRAP还原能力在0.01水平下显著正相关,相关系数分别为0.275和0.287。表明,在ABTS+·清除活性和FRAP还原能力两种抗氧化评价体系下,酚类化合物可能是黄皮疣柄牛肝菌表现抗氧化能力的重要因素之一。酚类化合物,如类黄酮、酚酸和缩合单宁通常被认为是植物抗氧化能力的主要贡献者[22]。同时,不同评价体系之间的相关性分析表明,DPPH·清除能力与FRAP还原能力和ABTS+·清除能力在0.01水平下显著正相关,相关系数为0.372和0.370。在0.05水平下,FRAP还原能力和ABTS+·清除能力成正相关,相关系数为0.263。不同评价体系之间的显著相关性表明,抗氧化测定方法是可靠的。不同的抗氧化反应体系适用于不同的氧化应激反应。因此,在测定物质抗氧化能力时,可以根据需要采用多种方法来综合评价其抗氧化活性。

表4 抗氧化活性与总酚含量相关性Table 4 Correlation between antioxidant activity and total phenol content

3 结论

本文初步探讨了云南主要产区25个位点黄皮疣柄牛肝菌的基本营养成分和抗氧化活性。研究发现黄皮疣柄牛肝菌具有高蛋白低脂肪、富含多酚的特点。菌体多酚粗提物对DPPH·、ABTS+·具有很好的清除能力,对Fe3+具有良好的还原能力,且具有很好的Fe2+螯合能力。酚类化合物与抗氧化活性相关性分析表明其可能是黄皮疣柄牛肝菌抗氧化活性的重要因素之一。云南产黄皮疣柄牛肝菌不仅基本营养成分丰富,是良好的膳食来源,而且抗氧化活性较好。本研究向消费者、营养学家和食品研究人员提供了关于黄皮疣柄牛肝菌体外抗氧化活性的新信息,为野生食用牛肝菌的资源利用提供了基础数据。