马钱苷元的制备及抗炎活性研究

杜丙源，梁红宝，陈小荣，齐长鹏，宁停波，宫海蕊

（山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400）

山茱萸是山茱萸科（Cornaceae）植物山茱萸Cornus officinalisSieb. et Zucc的成熟干燥果肉，是我国传统珍稀药材和常用名贵中药，有涩精、敛汗、补肝肾[1]、降血糖[2]等功效，研究表明，山茱萸还可增强免疫力[3]、抗肿瘤[4]。山茱萸主要有效成分为马钱苷。马钱苷为环烯醚萜苷类成分[5]，有降血糖、抗氧化[6]作用；吴云皓等[7]发现马钱苷能改善糖基化终产物（AGE）诱导的肾小球足细胞损伤；赵文望等[8]发现马钱苷和莫诺苷通过促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达和Caspase-3酶活性以抑制心肌细胞凋亡；党文军等[9]发现其对黑色素瘤细胞有抑制作用。马钱苷元为马钱苷脱去一分子葡萄糖后得到的淡黄色油状物，极性比马钱苷小，易溶于水、乙醇等溶剂，目前国内外对其报道很少。本实验初步探讨了马钱苷的Smith降解工艺，分离和确证水解产物，并研究水解产物抗炎活性，期望筛选活性更好的化合物，为进一步研究开发马钱苷及其衍生物提供科学依据。

1 仪器与材料

Ultimate3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）；Rotavapor R3旋转蒸发仪（Buchi）；ME204型电子天平（Mettler Toledo），马钱苷原料（含量90 %，西安昊轩）；马钱苷元对照品（成都曼思特），吲哚美辛组（西安迪赛生物药业），HPD450树脂（河北宝恩树脂），乙腈为色谱纯，高碘酸钠，硼氢化钠，甘油，盐酸均为国产分析纯。

色谱柱：Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（13:87）；柱温：30 ℃；检测波长240 nm；流速1 ml/min；进样量：10 μl。

2 方法与结果

2.1 马钱苷元制备

2.1.1 氧化反应 称取马钱苷10 g，加入10 %乙醇2000 ml溶解，在室温条件下，加入30 g高碘酸钠避光反应6 h；加入50 ml甘油终止反应，浓缩至无醇味，用等体积正丁醇萃取3次，合并萃取液，浓缩备用。

2.1.2 还原反应 将2.1.1中的氧化产物用1 L 50 %乙醇溶解，加10 g硼氢化钠，避光反应2 h，调pH至中性，备用。

2.1.3 水解反应 将2.1.2得到的还原产物加入500 ml水，其他反应参数酸度、温度、反应时间按表1，表2设计进行筛选，反应结束后，调pH至中性，浓缩至无醇味，浓缩液中加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩即得粗品。

表1 水解实验影响因素及水平

表2 水解实验正交实验分组及结果

2.1.4 精制纯化 取上述粗品用5倍纯化水溶解后，按物料比1:10用HPD450树脂上样吸附，然后按水，20 %，40 %，60 %乙醇依次进行3倍柱体积洗脱，收集40 %乙醇洗脱液，浓缩至无醇味；浓缩液加入10 mg活性碳进行吸附除杂，过滤后浓缩得淡黄色油状物，经HPLC检测油状物色谱纯度＞98 %。

2.1.5 结果分析 由表3可见，影响水解工艺马钱苷元纯度的因素影响程度B＞C＞A，其中影响最显著的为水解温度，而盐酸的酸度和反应时间影响不显著；但是反应时间越长，反应产物最后的得率越高。综合考虑生产成本和环保因素，得出最优试验条件为A1B3C2，重复此水解工艺3批，得3批纯度为 91.08 %，92.09 %，91.74 %，RSD=0.51 %，产率均达80 %以上。

表3 正交实验数据方差直观分析

2.2 马钱苷元结构确证

2.2.1 颜色反应 取已煮熟鸡蛋蛋清2 g，向蛋清滴加上述油状物水溶液2滴，静置2 h，观察可见，滴加上述油状物水溶液处变蓝色，表明此油状物为环烯醚萜类化合物苷元[10]。

2.2.2 ESI-MS分析

图1 油状物ESI-MS分析图

由图1可见，油状物的相对分子质量为228.1[M-H]+，而马钱苷元的相对分子质量为228.24，两者相同。

2.2.3 HPLC-UV分析

图2 对照品与油状物HPLC-UV分析图

由图2可见，经Smith降解最后得到的油状物与马钱苷元对照品出峰时间一致。

综合上述3种方法分析可见，此淡黄色油状物即为马钱苷元。

2.3 抗炎活性研究

采用小鼠耳肿胀法[11]研究马钱苷元抗炎活性。取雄性小鼠50只，随机分成5组，即生理盐水空白组、吲哚美辛组及马钱苷元高、中、低剂量组，分别按1.0，3.0，1.0，0.3 mg/kg配成水溶液灌胃；各组每日给药1次，连续给药3 d；最后一次给药后1 h，将二甲苯50 μl涂于小鼠右耳正反两面，致炎后30 min，脱臼处死小鼠；用内径6 mm直径打孔器在小鼠左、右耳相同部位打孔，取下耳片，用电子天平称重，计算左右耳重量差异及计算抑制率，结果见表4。

表4 马钱苷元对小鼠耳部肿胀的影响（n=10，x±s）

由表4可见，吲哚美辛对二甲苯所致小鼠耳肿的具有明显抑制作用，马钱苷元各剂量组也有不同程度的抑制作用，尤以高剂量组最明显；中剂量抗炎活性略低于高剂量的活性。

3 讨论

在酸性或碱性条件下，酯基易水解断裂，马钱苷具有酯基结构，因此制备马钱苷元时如直接采用酸水解或碱水解，副产物较多，甚至得不到马钱苷元。本实验经Smith降解可反应得到马钱苷元，Smith降解可有效保护酯基结构在反应过程中不易破坏，副产物少，易纯化处理，可用于大规模生产，为马钱苷元的生产提供了一种参考方法。

另外，利用二甲苯作为致炎因子，直观可见造模一侧的鼠耳有明显肿胀，质量明显大于未造模的一侧，表明本次造模成功。结果表明，不同剂量的马钱苷元均有抗炎活性，但是剂量不同，抗炎效果有差异，尤以高剂量的效果最佳，最接近阳性对照吲哚美辛组的效果。