PP242诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬和凋亡的机制研究

闫文帝，李珍玲，刘特思，李玉姬，原田宪一，任香善,2

(延边大学1. 肿瘤研究中心、2. 医学院病理学教研室，吉林 延边 133002；3. 金泽大学医学部病理学教研室，日本 金泽 9208640)

Caroli病是一种常染色体隐性遗传性多囊肾疾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)的肝胆管病变，主要表现为肝内胆管的扩张，常合并门脉高压及胆道炎症[1]。目前，其治疗手段主要为对症治疗或肝移植，尚无有效的治疗方案[2]。多囊肾(polycystic kidney，PCK)大鼠为Caroli病和ARPKD的常用动物模型，是目前为止唯一能够充分反映多发性胆管囊肿和肝纤维化的动物模型。

PI3K/Akt/mTOR是可以调节细胞增殖、凋亡和自噬的信号通路。研究表明，在乳腺癌、胃癌、肺癌等多种癌症中异常活化[3-4]。雷帕霉素是经典的mTOR抑制剂，是mTORC1的变构抑制剂，对多种肿瘤有抑制作用[5]。PP242可同时抑制mTORC1和mTORC2，减少负反馈导致的耐药问题[6]。研究证实，PI3K/Akt/mTOR信号通路中p-Akt、p-mTOR、p-S6等蛋白在ARPKD中呈高表达[7]，提示Akt/mTOR信号通路与ARPKD的发生、发展密切相关。目前为止，尚无PP242对Caroli病的研究报道。本研究旨在阐明mTOR的双重抑制剂PP242对PCK大鼠胆管上皮细胞增殖、凋亡和自噬的影响，进一步探究其机制，为Caroli病的临床治疗提供新的实验基础和理论依据。

1 材料

1.1细胞及组织标本正常和PCK大鼠胆管上皮细胞以及肝组织蜡块标本均由日本金泽大学病理学教研室提供。

1.2试剂雷帕霉素、PP242购自美国Sigma-Aldrich公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA) 购自Calbiochem公司，用DMSO配制浓缩液，分装保存于-20℃冰箱；Alexa-488荧光二抗及p-mTOR、p-Akt、Akt、p-4EBP1、4EBP1、LC3、Rictor、Beclin-1抗体，均购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自美国Abcam公司；ssDNA ELISA 凋亡试剂盒购自Millipore公司。

1.3仪器激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(日本Bay Bioscience公司)；EnVision+system(丹麦DakoCytomation公司)；全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1PCK模型的制备与分组PCK大鼠是Crj:CD(SD)大鼠的PKHD1基因自发突变而来的动物模型，由日本查尔斯河实验室的Katsuyama等[8]首次报道。2001年，日本金泽大学人体病理学实验室Sanzen等首次提出PCK大鼠可作为ARPKD，特别是伴有先天性肝纤维化(congenital hepatic fibrosis，CHF)的Caroli病的实验动物模型。本实验中使用的正常SD大鼠和PCK大鼠，均购自于日本查尔斯河实验室，动物实验的指导原则均按照日本金泽大学实验动物指南进行。

2.2大鼠胆管上皮细胞的分离与肝组织标本的制备胆管上皮细胞的分离方法如Sato等所述[9]，取8周龄的正常SD大鼠和PCK大鼠，用不含钙和镁的平衡盐溶液冲洗门静脉，再向门静脉内灌注含有0.04%胶原酶和0.22%分散酶的DMEM/F-12培养液静置20 min，待正常和PCK大鼠胆管上皮细胞分离后，置于含10%胎牛血清、5 μmol·L-1毛喉素、20 μmol·L-1表皮生长因子和1%青-链霉素的DMEM/F-12培养液，于37℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养。取10月龄正常和PCK大鼠的肝组织，4%甲醛缓冲液(pH 7.4)浸泡固定，石蜡包埋处理，将蜡块切成4 μm厚切片，备免疫组化染色用。

2.3免疫组织化学染色采用EnVision法，大鼠组织切片常规脱蜡及水化，梯度乙醇入水，抗原修复用10 nmoL·L-1枸橼酸盐柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)微波加热20 min，p-mTOR(Ser2448)(1 ∶200)和p-Akt(1 ∶25)一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，二甲基联苯胺(DAB)显色1～10 min，苏木精染核1 min，中性树脂封片。

2.4WST-1比色法PCK大鼠胆管上皮细胞经雷帕霉素(0、0.1、0.5、2 mg·L-1)和PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)处理24、72、120 h后，用WST-1比色法测定。500 nmol·L-13-MA预处理PCK大鼠胆管上皮细胞1 h后，与2 μmol·L-1PP242联合处理24 h，检测PP242处理后对胆管上皮细胞增殖的影响。

2.5AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡将细胞接种于35 mm培养皿，待细胞长到70%左右时，用药组用药处理24 h，阳性对照组加入200 μmol·L-1的H2O2处理24 h后，常规消化收集细胞，进行Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞仪进行检测。

2.6免疫蛋白印迹实验PCK大鼠胆管上皮细胞用PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)处理24 h，提取细胞总蛋白，加入蛋白裂解液(T-PER)。蛋白定量后，将40 μg蛋白经梯度胶电泳分离，电转至PVDF膜上，Akt (1 ∶1 000)、p-Akt (1 ∶1 000)、4EBP1(1 ∶1 000)、p-4EBP1 (1 ∶1 000)、LC3 (1 ∶500)、Rictor (1 ∶1 000)和Beclin-1 (1 ∶500) 4℃孵育过夜，加HRP标记二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显色，ChemiDOC成像系统拍照，Image J软件进行结果分析。

2.7免疫荧光染色细胞接种于8孔细胞培养玻片，2 μmol·L-1PP242处理24 h，用4%多聚甲醛固定，用0.1%的Triton X-100处理10 min，血清封闭，LC3抗体(1 ∶200)4℃孵育过夜，DAPI染细胞核，封片后拍照观察。

2.8LC3、Rictor和Beclin-1基因沉默实验LC3、Rictor和Beclin-1的siRNA 和阴性对照均购自Qiagen公司，干扰序列见Tab 1。siRNA转染使用HiPerFect转染试剂，按试剂盒说明进行操作。PCK大鼠胆管上皮细胞培养24 h后，更换成DMEM/F-12培养液、siRNA (10 nmol·L-1)和3 μL HiPerFect转染试剂液的混合液，继续培养72 h。

Tab 1 Interference sequences of LC3, Beclin-1 and Rictor

2.9ELISA检测ssDNAELISA实验是根据甲酰胺对凋亡细胞的感受性，选择性地定量检测凋亡细胞中的单链DNA(single-strand DNA,ssDNA)的检测方法。PCK大鼠胆管上皮细胞用2 μmol·L-1的PP242处理24 h后，收集细胞上清液，离心后，将样本按1 ∶100稀释，微孔加入样本处理30 min，酶标记抗人IgG抗体处理30 min，加入底物显色剂15 min(避光)，加入终止液后，用全波长分光光度仪在450 nm处检测吸光值，统计分析，以大于0.1 IU·L-1为阳性。

2.103D细胞培养将细胞混悬于Matrigel中，细胞均匀接种到24孔板中，待Matrigel凝固后，加入常规培养液培养至d 6，更换含有100 nmol·L-1雷帕霉素和2 μmol·L-1PP242的培养液继续培养72 h，换液后d 0、3，每个视野选择3～5个细胞球拍照记录，并用Image J分别测量d 0、3同一细胞球的直径，计算增殖率：增殖率/%=(d 3直径-d 0直径)×100%。

3 结果

3.1p-mTOR和p-Akt蛋白在PCK大鼠胆管上皮细胞中呈高表达Fig 1大鼠肝组织免疫组化染色结果显示，p-mTOR和p-Akt蛋白在正常大鼠胆管上皮细胞中呈弱阳性表达，而在PCK大鼠胆管上皮细胞中呈强阳性表达。p-mTOR蛋白阳性颗粒主要位于肝细胞和胆管上皮细胞的细胞核和细胞质，而p-Akt 蛋白主要位于肝细胞和胆管上皮细胞的细胞核。

3.2雷帕霉素和PP242对胆管上皮细胞增殖的影响正常和PCK大鼠胆管上皮细胞分别用0、0.1、0.5、2 mg·L-1的雷帕霉素和0、0.1、0.5、2 μmol·L-1的PP242处理24、72、120 h后发现，与对照组相比，雷帕霉素和PP242药物处理后的胆管上皮细胞的增殖受到明显抑制，且呈浓度依赖性(P<0.05)。在同一时间、同一浓度下，PP242比雷帕霉素的抗增殖效果更明显(Fig 2A、2B)。

Fig 1 Expression of p-mTOR and p-Akt in bile duct epithelial cells examined by immunohistochemistry (×200)

3.3雷帕霉素和PP242下调PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达不同浓度的雷帕霉素和PP242处理PCK大鼠胆管上皮细胞24 h后，p-Akt和p-4EBP1的蛋白表达水平随着药物浓度的增高而降低，且在2 μmol·L-1时抑制效果最为明显。在相同浓度作用下，PP242对磷酸化Akt和4EBP1的抑制效果更明显(Fig 2C、2D)。

3.4PP242诱导PCK大鼠胆管上皮细胞凋亡流式细胞术结果显示，PP242组细胞凋亡率明显高于对照组(Fig 3A)。ssDNA ELISA实验结果显示，PP242组细胞凋亡率明显高于对照组(Fig 3B)。蛋白印迹实验结果显示，cleaved caspase-3表达明显上调(Fig 3C)。以上结果提示，PP242可诱导PCK大鼠胆管上皮细胞凋亡。

3.5PP242诱导PCK大鼠胆管上皮细胞自噬蛋白免疫印迹结果显示，0、0.1、0.5、1、2 μmol·L-1PP242作用于PCK大鼠胆管上皮细胞24 h后，随着药物浓度的增加，自噬标识蛋白LC3-II/ LC3-I的比值以及Beclin-1呈逐渐升高的趋势，表明PP242能诱导PCK大鼠胆管上皮细胞发生自噬，且呈浓度依赖性(Fig 3D)。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，2 μmol·L-1PP242处理组细胞胞质中LC3绿色荧光颗粒含量明显增多，荧光强度也明显增强(Fig 3E)。

Fig 2 Effect of rapamycin and PP242 on viability of bile duct epithelial cells and protein level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway n=3 )

A, B: The effect of rapamycin (mg·L-1) and PP242 (μmol·L-1) on proliferation in bile duct epithelial cells detected by WST-1 assay;*P<0.05vs24 h control;#P<0.05vs72 h control;△P<0.05vs120 h control. C，D: The effect of rapamycin and PP242 on the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes detected by Western blot.*P<0.05vscontrol.

3.6mTOR抑制剂抑制PCK大鼠胆管上皮细胞成球能力3D细胞培养结果显示，PP242组在处理72 h后，与对照组相比，细胞成球能力明显受到抑制(Fig 4A、4B)。蛋白印迹结果显示，Rictor基因沉默后其蛋白表达水平明显下调(Fig 4D)。为进一步探寻mTORC2对细胞生长的抑制作用，使用小干扰RNA处理mTORC2复合物Rictor，结果发现，Rictor基因沉默对PCK大鼠胆管上皮细胞成球能力并未产生明显影响，但当与雷帕霉素联合作用时，细胞的成球能力明显受到抑制(Fig 4C、4E)。提示mTORC1和mTORC2共同抑制可明显降低PCK大鼠胆管上皮细胞的成球能力，mTORC1/C2抑制剂PP242可明显抑制胆管上皮细胞的增殖。

3.7LC3、Beclin-1siRNA和3-MA可逆转PP242对PCK大鼠胆管上皮细胞增殖的抑制效应为了观察PP242抑制胆管上皮细胞增殖过程中自噬的作用，使用LC3和Beclin-1基因沉默方法及自噬抑制剂3-MA后，检测PP242对PCK大鼠胆管上皮细胞增殖的影响。LC3基因沉默效果用免疫荧光染色方法鉴定，结果显示，LC3基因沉默后，细胞质内的绿色荧光颗粒明显减少(Fig 5A)。Beclin-1基因沉默后，用蛋白印迹方法鉴定，结果显示，Beclin-1基因沉默后其表达明显下调(Fig 5B)。

LC3和Beclin-1 siRNA对PCK大鼠胆管上皮细胞活力的影响甚微，而与PP242共同处理可明显增加细胞增殖活力(P<0.05)，见Fig 5C、5D。单独使用0.5 μmol·L-13-MA时，对大鼠胆管上皮细胞活力的影响甚微，但3-MA与PP242共同处理后，减弱PP242对细胞活力的抑制效果(P<0.05)，见Fig 5E。上述结果提示，PP242诱导的自噬是抑制PCK胆管上皮细胞生长的主要机制之一。

Fig 3 Effect of PP242 on apoptosis and autophagy of PCK rat cholangiocytes

A: The effect of PP242 (μmol·L-1) on apoptosis detected by Annexin V/PI double staining; B: The effect of PP242 on apoptosis detected by ELISA; C: The expression of cleaved caspase-3 increased in the PCK rat cholangiocytes treated with PP242; D: The bile duct epithelial cells treated with different concentrations of PP242 and rapamycin (mg·L-1) for 24 h, the level of Beclin-1 and the ratio of LC3-II/LC3-I increased; E: The protein expression of LC3 increased in PCK rat cholangiocytes treated with PP242 (immunofluorescence staining, ×400).*P<0.05vscontrol.

4 讨论

Caroli病，即先天性肝内胆管扩张症，其病因不明，在病情进展中出现多种并发症，且7%左右的患者可发展为胆管癌[10]，目前临床上尚无有效的治疗方案。PI3K/Akt/mTOR信号通路是与细胞增殖、凋亡和自噬相关的信号通路[11]。本研究发现，p-Akt和p-mTOR蛋白的表达水平在PCK大鼠胆管上皮细胞中明显增高，提示Akt/mTOR信号通路的异常活化是导致PCK大鼠胆管上皮细胞过度生长的机制之一。

雷帕霉素是一种对mTORC1有效的mTOR抑制剂，但对mTORC2不敏感。当使用雷帕霉素时，mTORC2磷酸化Akt 473位点，负反馈激活PI3K/Akt/mTOR通路，导致部分患者在应用雷帕霉素数月后发生复发和耐药，使雷帕霉素在临床的应用受到限制[12]。PP242是一种ATP竞争性mTORC1/2双重抑制剂，其主要靶点是mTORC2，可同时抑制mTORC1和mTORC2。Qin等[13]研究发现，PP242可通过诱导凋亡和自噬抑制卵巢癌细胞的生长。本研究发现，PP242和雷帕霉素两者均可抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的增殖，且呈时间-浓度依赖性，其机制是下调PI3K/Akt/mTOR下游蛋白p-Akt和p-4EBP1的表达。而同等浓度下，PP242的抑制效果明显强于雷帕霉素。在PP242处理胆管上皮细胞后，其成球能力明显减弱。我们研究发现，单用雷帕霉素对细胞成球能力影响甚微，而Rictor基因沉默与雷帕霉素联用后，细胞成球能力明显受到抑制。提示mTORC1和mTORC2的共同抑制与mTORC1单独抑制相比，其抑制胆管上皮细胞增殖的能力更明显。

Fig 4 Effect of PP242 and Rictor gene silencing and rapamycin on ability of cell formation(×400)

A, B: The effects of rapamycin(100 nmol·L-1), Rictor siRNA and with rapamycin on bile duct epithelial cells spheroid formation examined for PCK cholangiocytes using three-dimensional cell culture system, PP242(2 μmol·L-1) significantly inhibited cystic growth of PCK cholangiocytes; C, E: Knockdown of Rictor with siRNA of PCK cholangiocytes treated with rapamycin significantly decreased the bile duct epithelial cells spheroid formation. D: The results of Western blot showed the silencing of Rictor for 72 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsRictor siRNA.

Qu等[14]研究发现，PP242可诱导急性骨髓性白血病小鼠的白血病细胞凋亡。本研究发现，PP242处理后，细胞凋亡数量明显增多，凋亡相关蛋白clevead caspase-3的表达随着药物浓度的升高而升高。提示PP242可诱导PCK大鼠胆管上皮细胞的凋亡。

Jin等[15]研究发现，当细胞发生自噬时，LC3-I与磷脂酰乙醇胺共价结合后转变为LC3-II，进一步结合在自噬体膜上，因此，当LC3-II/LC3-I比值增高时说明细胞产生了自噬。本研究发现，PP242处理后，LC3-II/LC3-I的比值增高，细胞内LC3绿色免疫荧光颗粒表达增多，提示PP242处理后可诱导PCK大鼠胆管上皮细胞自噬。为了进一步探讨PP242诱导PCK大鼠胆管上皮细胞自噬的机制，我们观察了LC3、Beclin-1基因沉默和自噬抑制剂3-MA对细胞增殖活力的影响。研究发现，LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA本身对细胞增殖影响甚微，但其与PP242联用后，可明显逆转PP242对细胞增殖的抑制作用，提示诱导细胞自噬是其抑制胆管上皮细胞生长的主要机制之一。提示PP242可诱导PCK大鼠胆管上皮细胞生长抑制，其机制与诱导细胞自噬相关。

综上所述，与单独雷帕霉素相比，mTORC1/2抑制剂PP242对PCK大鼠胆管上皮细胞生长抑制效果更明显，其机制与诱导凋亡和自噬相关。提示PP242有望成为Caroli病的治疗药物，并有待更进一步的探究。

Fig 5 Effects of LC3 siRNA, Beclin-1 siRNA and 3-MA on proliferation of PCK rat cholangiocytes inhibited by PP242

A: The results of immunofluorescence showed the silencing of LC3 for 72 h; B: The results of Western blot showed the silencing of Beclin-1 for 72 h; C, D: The effect of LC3 siRNA or Beclin-1 siRNA for 72 h and PP242 (μmol·L-1) for 48 h together on the proliferation of the cholangiocytes detected by WST-1 assay.*P<0.05,**P<0.01vsnegative siRNA and PP242; E: The effect of 3-MA (500 nmol·L-1) and PP242 together for 48 h on the proliferation of cholangiocytes detected by WST-1 assay.#P<0.05vsPP242.