橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

邓小敏 于洁 陈莹 晁金泉 张世鑫 田维敏

摘要：【目的】克隆橡膠树乳管细胞短链异戊烯基合酶（GPPS）基因，分析其表达特性和编码蛋白的相互作用，为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考。【方法】采用逆转录PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速克隆（RACE）从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因（HbGPPS1和HbGPPS2），利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理的响应模式，并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系。【结果】从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因，其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp，编码415个氨基酸，蛋白分子量为45.9 kD，理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp，编码412个氨基酸，蛋白分子量为45.6 kD，理论等电点为6.77。二者的核苷酸序列相似性为89%，且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD（D），定位于叶绿体和线粒体。HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体。qRT-PCR检测结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮，但均以HbGPPS2基因表达量较高，表明二者表达存在组织特异性。经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高，即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成，激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达。在5个橡胶树栽培品系中，HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因，且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致，但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异。HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达。【结论】HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因，而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关，可用作为干胶含量评估的筛选标记。

关键词： 橡胶树;乳管细胞;短链异戊烯基合酶（GPPS）;基因克隆;表达水平;蛋白相互作用

中图分类号： S794.1                                 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2117-12

Cloning and expression analysis of GPPS genes from the

laticifer cells of Hevea brasiliensis

DENG Xiao-min1， YU Jie2， CHEN Ying2， CHAO Jin-quan1，

ZHANG Shi-xin1， TIAN Wei-min1*

（1Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan  571737， China; 2Institute of Tropical Agriculture and Forestry，

Hainan University， Danzhou，Hainan  571737， China）

Abstract：【Objective】The short-chain isopentenyl synthase（GPPS） genes from the laticifer cells of Hevea brasiliensis were cloned and interaction between their expression patterns and encoding proteins were further analyzed in this study for dissecting the function of the GPPS genes in the biosynthesis of natural rubber and terpenoids. 【Method】Reverse transcription-PCR（RT-PCR） and rapid amplification of cDNA ends（RACE） methods were performed to clone the GPPS genes from the laticifer cells of H. brasiliensis. The character of GPPS genes encoding proteins were analyzed by bioinformatics. Moreover， real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） was used to assess tissue-specific expression of GPPS genes from H. brasiliensis in the bark and latex and expression pattern of GPPS genes in different clones of H. brasiliensis. qRT-PCR was also used to detect response models of GPPS genes to tapping and exogenous methyl jasmonate（MeJA） treatment. And expression analysis of GPPS-encoding genes was done in prokaryotic cells. The protein interactions of HbGPPS1 and HbGPPS2 proteins were detected by using yeast two-hybrid technique. 【Result】Genes HbGPPS1 and HbGPPS2 were successfully cloned from the latex of laticifers cells in H. brasiliensis. HbGPPS1 gene harboured a coding frame of 1248 bp in length that encoded 415 amino acids with the protein molecular weight of 45.9 kD and the theo-retical isoelectric point（pI） of 6.77. While the gene HbGPPS2 harboured a coding frame of 1239 bp in length that enco-ded 412 amino acids with the protein molecular weight of 45.6 kD and the pI of 6.77. The similarity of their nucleotide sequence was up to 89%. The encoding proteins harbored two active prenyl transferase domain DDXXD（D） which were located in chloroplast and mitochondria. Protein interaction assay demonstrated that HbGPPS1 protein harbored relatively weak interaction with itself or with HbGPPS2 protein. Detection results of qRT-PCR revealed that both HbGPPS1 and HbGPPS2 had higher expression levels in latex than that in the bark， and the HbGPPS2 gene had higher expression levels than HbGPPS1 gene in both latex and bark，indicating their tissue-specific expression patterns. The expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes after MeJA treatment were higher than control，suggesting that exogenous MeJA treatment could promote the biosynthesis of endogenous jasmonate acid and activate jasmonate acid signaling in laticifer cells， then up-regulate expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes. Among the five H. brasiliensis cultivated clones，the relative expression level of HbGPPS2 gene was largely higher than that of HbGPPS1. And the expression levels of HbGPPS1 and HbGPPS2 genes were consistent with the dry rubber content tendency of PR107， CATAS7-20-59， RRIM600 and CATAS7-33-97， while showed little differences in expression pattern between CATAS8-79 and CATAS7-33-97. And HbGPPS2 gene was successfully expressed in Escherichia coli. 【Conclusion】HbGPPS2 gene may be the major gene in the biosynthesis of natural rubber and terpenoids in laticifer cells， while the HbGPPS1 gene may be the functionally redundant gene. The expression patterns of HbGPPS2 and HbGPPS1 genes show a positive correlation with the dry rubber content in different clones of H. brasiliensis， so they could be used as the selective molecular marks for evaluating the dry rubber content of H. brasiliensis.

Key words： Hevea brasiliensis; laticifer cells; short-chain isopentenyl synthase（GPPS）; gene cloning;expression level; protein interaction

0 引言

【研究意义】橡胶树乳管细胞是天然橡胶的主要合成场所，由形成层纺锤状原始细胞分化而成，不同乳管细胞相互连通形成橡胶树网状的特化组织，将其割破即可获得胶乳用于提取天然橡胶（Hao and Wu，2000）。我国南方热带地区的植胶区为非传统植胶区，天然橡胶产量无法满足国内市场需求，其原因是天然橡胶的合成与调控机理尚不清楚，制约了我国植胶区高产橡胶树品种的选育（鞠岩峰等，2014）。据研究报道，天然橡胶是由橡胶树乳管细胞中发生特异的类异戊二烯代谢而合成，即在橡胶树乳管细胞中短链异戊烯基合酶（GPPS）能将1分子的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）催化合成1分子的牻牛儿基焦磷酸（GPP），进而形成天然橡胶合成的起始化合物法尼基焦磷酸（FPP）（Cornish and Siler，1995;Chow et al.，2012）。因此，克隆橡胶树乳管细胞GPPS基因，研究其编码蛋白生物学信息及表达特性，对高产橡胶树品种选育具有重要意义。【前人研究进展】GPPS广泛存在于植物中，主要参与组织特异单萜和倍半萜物质的合成。目前，已从拟南芥（Bouvier et al.，2000）、金鱼草（Tholl et al.，2004）、葡萄（Martin et al.，2012）、长春花（Rai et al.，2013）、薄荷（于盱等，2013）、滇龙胆（王彩云等，2014）和雷公藤（屠李婵等，2017）等植物中克隆获得GPPS基因。大量研究证实，该基因参与调控薄荷醇（Burke et al.，1999）、黄酮（Bouvier et al.，2000）和单萜吲哚生物碱（Rai et al.，2013）等萜类物质的合成，其调控机理受基因表达水平、蛋白翻译水平、亚细胞器特异分布和蛋白聚合形式等影响（Burke et al.，1999;Bouvier et al.，2000;Wang and Dixon，2009;Rai et al.，2013）。GPPS分布在叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等亚细胞器中，参与特异的生化过程（Bouvier et al.，2000;Wang and Dixon，2009;Rai et al.，2013）。在生化过程中，GPPS通过形成同源二聚体（同聚肽）或异源二聚体（杂聚肽）调控GPP的代谢方向（Rai et al.，2013），但不同植物存在差异，如拟南芥（Bouvier et al.，2000）、冷杉（Buke and Croteau，2002）和番茄（van Schie et al.，2007）等植物GPPS蛋白以同源二聚体形式发挥作用，而薄荷（Burke and Croteau，1999）、金鱼草（Tholl et al.，2004）和啤酒花（Wang and Dixon，2009）的GPPS蛋白以杂聚肽形式发挥作用，长春花GPPS蛋白同时存在同聚肽（CrGPPS）和杂聚肽（CrGPPS.LSU和CrGPPS.SSU）的结构，其中杂聚肽小亚基CrGPPS.SSU能结合大亚基CrGPPS.LSU并改变其对底物的亲和力，进而改变产物的合成途径（Rai et al.，2013）。【本研究切入点】虽然橡胶树基因组测序已完成（Tang et al.，2016），为研究MVA和MEP代谢通路基因及其功能打下了基础，但乳管细胞中天然橡胶的合成机理尚不清楚。由于天然橡胶合成的原料是IPP和DMAPP，与萜类物质合成前体相同，而GPPS为胶乳中重要内含物天然橡胶和角鲨烯的形成提供所需的GPP前体物，因此克隆橡胶树乳管细胞GPPS基因，研究其表达水平变化与编码蛋白间相互作用的性质有助于解析其在天然橡胶和活性萜类合成机制。但至今鲜见有关系统研究橡胶树乳管细胞的GPPS基因功能的文献报道。【拟解决的关键问题】从橡胶树乳管细胞的胶乳cDNA中克隆GPPS基因，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在树皮和胶乳中的组织表达特异性及不同橡胶树品系中的表达模式，并分析其对割胶和外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理的响应模式及在原核细胞中的表达情况，检测GPPS蛋白間的相互作用，为揭示橡胶树GPPS基因在乳管细胞中天然橡胶和活性萜类物质所需GPP前体合成的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试橡胶树品系为PR107、RRIM600、热研7-20-59、热研8-79和热研7-33-97，均为我国植胶区的常规品种，种植于中国热带农业科学院试验场，其中热研7-33-97的基因组序列已测序完成。植物总RNA提取试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;cDNA反转录试剂盒和蛋白预染Marker购自Thermal Fisher scientific公司;DNA胶回收试剂盒和SYBR? Premix Ex Taq?荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1和pEASY-Blunt克隆载体试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自NEB（北京）公司;IPTG和LB培养基购自生工生物工程（上海）股份有限公司;大肠杆菌BL21（DE3）由海南省热带作物栽培生理学重点实验室保存提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品处理及采集 分别采集10棵7年生成熟热研7-33-97品系的未开割树和新开割（割制阳刀1/2树围，4天一刀，即S/2 d/4）1年的树皮和胶乳样品，将每棵树的胶乳样品进行等体积混合，每棵树的树皮样品进行等质量混合（割胶面树皮样品在称量之前先去掉外皮层附着的真菌、苔藓层及内层残留的胶乳），用于检测GPPS基因在树皮和胶乳中的表达水平。

选取新开割的不同橡胶树品系PR107、RRIM600、热研7-20-59、热研8-79和热研7-33-97各10棵，用离心管收集每棵树前5 min流出的胶乳样品，置于冰上保存，再将各品系的10棵树胶乳样品进行等体积混合，用于检测GPPS基因在不同橡胶树品系胶乳中的表达水平。

参照Zhang等（2015）的方法，利用0.07%茉莉酸甲酯（MeJA，3.19 mmol/L）处理热研7-33-97的1年生萌条4、12和24 h，其中每個时间点处理10棵，然后采集胶乳进行等体积混合。以未处理的热研7-33-97的1年生萌条作为对照（CK）。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA合成 利用植物总RNA提取试剂盒分别提取树皮和胶乳混合样品总RNA，并利用cDNA反转录试剂盒合成cDNA。

1. 2. 3 引物设计及合成 根据NCBI数据库中的一个橡胶树GPPS基因序列（GenBank登录号XM_021798994），使用Primer Premier 5.0设计该基因的特异扩增引物，在胶乳cDNA模板中克隆该基因，命名为HbGPPS1基因。

根据NCBI数据库中的另一个GPPS基因对应8个转录本，GenBank登录号分别是XM_021820794、XM_021820787、XM_021820793、XM_021820792、XM_021820790、XM_021820788、XM_021820789和XM_021820776，由于这些转录本3'端不一致，因此难以确定该GPPS基因的编码框序列。为从胶乳cDNA中克隆该基因编码框序列全长，通过Primer Premier 5.0设计其3'RACE引物（表1），利用巢式PCR克隆其3'末端序列，具体方法参照SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit（PT3269-1）说明。利用Primer Premier 5.0设计其引物以克隆编码框序列全长，将克隆获得的GPPS基因命名为HbGPPS2基因。最后，设计HbGPPS1基因和HbGPPS2基因的特异荧光定量引物（表1）检测其相对表达量。引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1. 2. 4 PCR扩增及测序分析 PCR反应体系20.0 μL：2×PrimerSTAR Max Permix 10.0 μL，10 μmol/L正、反向基因扩增引物（HbGPPS1-F/HbGPPS1-R、HbGPPS2-F/HbGPPS2-R）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，灭菌去离子水补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。切割目的条带进行胶回收纯化，连接至pEASY-Blunt载体（25 ℃连接20 min）后转化Trans1-T1感受态细胞，涂布在含50 mg/L氨苄青霉素的LA培养基上，置于37 ℃恒温培养箱进行过夜培养。挑取培养基上的菌落进行PCR验证，将阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1. 2. 5 实时荧光定量PCR检测 利用实时荧光定量PCR检测HbGPPS1和HbGPPS2基因在树皮和胶乳中的相对表达量及其对割胶和茉莉酸的响应模式（邓小敏等，2016）。反应体系10.0 μL：SYBR Premix Ex Taq II 5.0 μL，正、反向荧光定量PCR引物（qRT-HbGPPS1-F/qRT-HbGPPS1-R、qRT-HbGPPS2-F/qRT-HbGPPS2-R）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，灭菌去离子水补足至10.0 μL。将其置于CFX384 Real-time PCR System上进行扩增。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环。以橡胶树18S基因为内参基因。基因的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算

1. 2. 6 生物信息学分析 基于HbGPPS1和HbGPPS2基因的核苷酸序列推导其编码蛋白的氨基酸序列，利用DNAMAN 2.0对二者的氨基酸序列进行比对分析，并利用ClusterW 2.0和MEGA 5.0构建系统发育进化树以分析二者与其他植物GPPS蛋白的亲缘关系。此外，使用SMART对HbGPPS1和HbGPPS2蛋白进行结构域预测，采用TMHMM Server 2.0、WOLF PSORT和TargetP 1.1预测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的跨膜结构域和亚细胞定位。

1. 2. 7 原核表达分析 分别利用pMAL-HbGPPS1-F/pMAL-HbGPPS1-R和pMAL-HbGPPS2-F/pMAL-HbGPPS2-R引物PCR扩增HbGPPS1和HbGPPS2基因的编码框序列，PCR反应体系和扩增程序与1.2.4相同，将目的片段分别连接至pEASY克隆载体并转化Trans1-T1感受态细胞，具体方法同1.2.4。从测序正确的阳性菌中提取重组质粒（pEASY-HbGPPS1和pEASY-HbGPPS2），用Nde I和EcoR I双酶切pEASY-HbGPPS1和原核表达载体pMAL[携带麦芽糖结合蛋白（MBP）标签];同时用Sal I和EcoR I双酶切pEASY-HbGPPS2和原核表达载体pMAL。切胶回收纯化后用T4 DNA连接酶分别将HbGPPS1和HbGPPS2与原核表达载体pMAL连接，并转化Trans1-T1感受态细胞，涂布于含50 mg/L氨苄青霉素的LA培养基上，置于37 ℃恒温培养箱进行过夜培养。菌落PCR鉴定后送阳性克隆至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

参照邓小敏等（2017）的方法，以重组质粒pMAL-HbGPPS1和pMAL-HbGPPS2转化大肠杆菌BL21（DE3），经菌落PCR鉴定阳性克隆后，挑取单克隆培养至OD600 nm为0.5后添加1 mmol/L IPTG进行诱导表达，经16 ℃诱导表达过夜后超声破碎细胞，20000 r/min离心10 min，收集上清液和包涵体沉淀。利用SDS-PAGE检测HbGPPS1-MBP和HbGPPS2-MBP重组蛋白的表达情况（Shi et al.，2016）。

1. 2. 8 蛋白相互作用分析 参照邓小敏等（2018）的方法进行酵母双杂交试验以检测橡胶树HbGPPS1与HbGPPS1蛋白间，HbGPPS1与HbGPPS2蛋白间及HbGPPS2与HbGPPS2蛋白间的相互作用关系。分别将克隆获得的HbGPPS1和HbGPPS2基因编码区序列连接至pGADT7和pGBKT7载体上，以构建pGADT7-HbGPPS1、pGADT7-HbGPPS2、pGBKT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2酵母表达载体，具体构建方法参照1.2.7。分别将pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7空载体，pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7空载体，pGBKT7-HbGPPS1和pGADT7空载体及pGBKT7-HbGPPS2和pGADT7空载体成对共转化酵母感受态细胞（王靖等，2016），转化的酵母涂布在未加X-α-gal的二缺筛选培养基（SD/-Trp-Leu）和添加40 μg/mL X-α-gal的四缺筛选培养基（SD/-Ade-His-Trp-Leu）上，30 ℃培养7 d后拍照记录。以pGBKT7-p53和pGADT7-SV40-T共转化的酵母菌为阳性对照，以pGBKT7-Lam和pGADT7-SV40-T共转化的酵母菌为阴性对照。四缺筛选培养基（SD/-Ade-His-Trp-Leu）上酵母菌的生长状况和显色程度可反映待检测蛋白间相互作用的强弱。

1. 3 统计分析

采用Student检验方法分析HbGPPS1和HbGPPS2基因在不同组织、不同割胶处理或MeJA处理下相对表达量的差异显著性。利用SPASS 17.0的Duncans检验分析HbGPPS1和HbGPPS2基因在橡胶树不同品系中的表达水平差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 GPPS基因的PCR扩增结果

根据NCBI数据库中的一个橡胶树GPPS基因（GenBank登录号XM_021798994）设计特异性扩增引物，从基因组已测序的热研7-33-97品系乳管细胞胶乳cDNA中克隆得到1519 bp的特异条带，测序结果显示，该基因编码框长度为1248 bp，编码415个氨基酸，蛋白分子量为45.9 kD，理论等电点为6.77，命名为HbGPPS1基因。

根据NCBI数据库中的另一个橡胶树GPPS基因对应到8个3'端存在差异的转录本，利用3'RACE引物从热研7-33-97品系乳管细胞胶乳cDNA中克隆获得其3'端序列，再根据5'端和3'端序列设计引物克隆其编码框全长，结果显示，该基因全长为1603 bp，包含一个完整的编码框（1239 bp），编码412个氨基酸，蛋白分子量为45.6 kD，理论等电点为6.77，命名为HbGPPS2基因，将其序列提交至NCBI数据库，获得新的GenBank登录号MH636812（图1）。序列比对分析结果表明，HbGPPS1和HbGPPS2基因的核苷酸序列相似性为89%。

2. 2 GPPS蛋白的生物信息学分析结果

由图2可知，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的氨基酸序列相似性为92%。由图3可知，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白与同为大戟科的木薯（Manihot esculenta L.）、麻风树（Jatropha curcas L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）GPPS蛋白同源性较高，其中HbGPPS1与MeGPPS1（XP_021608363.1）、MeGPPS2（XP_0216 08364.1）、JcGPPS1（XP_012072828.1）和RcGPPS1（XP_002530137.1）的同源性分别为95%、96%、91%和92%，但与菊科的橡胶草（Taraxacum kok-saghyz L.）TkGPPS1（AMB19718.1）同源性较低，为82%，与长春花（Catharanthus roseus L.）CrGPPS2（AGL91647.1）和CrGPPS.LSU（AGL91645.1）的同源性分别为84%和46%;HbGPPS2与MeGPPS1、MeGPPS2、JcGPPS1和RcGPPS1的同源性分别为89%、89%、87%和88%，与橡胶草TkGPPS1的同源性仅75%，而与CrGPPS2和CrGPPS.LSU的同源性分别为81%和49%。

结构域預测结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸（Asp，简写为D）的基序FARM（First aspartate-rich motif，DDXXDD）和SARM（Second aspartate-rich motif，DDXXD），是典型的异戊烯基转移酶活性结构域，主要负责底物结合和转化（Bouvier et al.，2000;Rai et al.，2013）。

TMHMM预测结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白不含有跨膜螺旋结构。WOLF PSORT预测结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白定位在叶绿体（定位系数chlo：8.0）和线粒体（定位系数mito：4）。TargetP 1.1预测结果显示，HbGPPS1定位在线粒体和叶绿体，定位系数为0.868和0.110，可信等级为2级;而HbGPPS2定位在线粒体和叶绿体，定位系数为0.942和0.049，可信等级为1级。

2. 3 橡胶树GPPS基因的表达分析结果

由图4可知，HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量均极显著高于在树皮中的表达量（P<0.01，下同），且HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于HbGPPS1基因，但HbGPPS1基因在树皮中的表达量高于HbGPPS2基因，说明二者的表达存在组织特异性。

由图5可知，HbGPPS1和HbGPPS2基因在开割树胶乳中的表达量显著（P<0.05）或极显著高于未开割树胶乳，表明割胶处理能上调HbGPPS1和HbGPPS2基因的转录水平。

由图6可知，MeJA处理12和24 h时橡胶树胶乳中HbGPPS1基因和HbGPPS2基因表达量极显著高于CK，但HbGPPS1基因的表达量在12 h达最高，HbGPPS2基因在24 h达最高，表明通过外施MeJA可激活内源茉莉酸的合成，进而激活乳管细胞内的茉莉酸信号。

由图7可知，HbGPPS1基因和HbGPPS2基因在PR107、RRIM600和热研7-20-59、热研8-79和热研7-33-97胶乳中的表达水平存在明显差异，HbGPPS1基因的表達量排序为PR107>热研7-20-59>RRIM600>热研8-79>热研7-33-97。HbGPPS2基因的表达量排序为PR107 >热研7-20-59>RRIM600>热研7-33-97>热研8-79，表明HbGPPS1和HbGPPS2基因在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异，在其他3个品系中表达模式一致。在5个橡胶树栽培品系中，HbGPPS2基因的表达量均高于HbGPPS1基因，表明HbGPPS2基因可能是参与异戊二烯代谢途径的主效基因，而HbGPPS1基因可能为功能冗余基因。

2. 4 GPPS基因的原核表达分析结果

将构建的pMAL-HbGPPS1和pMAL-HbGPPS2重组质粒转化原核表达菌株BL21（DE3）后进行IPTG诱导表达，蛋白表达情况用SDS-PAGE进行检测，结果如图8所示。由于MBP标签蛋白约48.0 kD，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白约46.0 kD，因此，重组蛋白HbGPPS1-MBP和HbGPPS2-MBP约94.0 kD。在上清液和包涵体沉淀均检测到重组蛋白，其中红色箭头表示HbGPPS1-MBP重组蛋白条带（图8-A），绿色箭头表示HbGPPS2-MBP重组蛋白条带（图8-B），说明HbGPPS1和HbGPPS2蛋白在原核细胞中成功表达。

2. 5 GPPS蛋白的相互作用分析结果

GPPS蛋白能通过形成不同的同源或异源二聚体来行使生物学功能（Rai et al.，2013）。本研究通过酵母双杂交试验检测HbGPPS1和HbGPPS2能否形成同源或异源二聚体，结果如图9所示。pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7共转化的酵母菌、 pGBKT7-HbGPPS1和pGADT7共转化的酵母菌、pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7共转化的酵母菌及pGBKT7-HbGPPS2和pGADT7共转化的酵母菌均能在SD/-Trp-Leu培养基上生长，但不能在SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基（含X-α-gal）上生长，表明HbGPPS1和HbGPPS2本身不具有激活报告基因表达的活性。

pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS1共转化的酵母菌、pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2共转化的酵母菌，pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7-HbGPPS2共转化的酵母菌及阳性对照（pGADT7-SV40-T和pGBKT7-p53共转化的酵母菌）和阴性对照（pGADT7-SV40和pGBKT7-Lam共转化的酵母菌）均能在SD/-Trp-Leu培养基上生长，但仅pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS1共转化的酵母，pGADT7-HbGPPS1和pGBKT7-HbGPPS2共转化的酵母菌及阳性对照能不同程度地在SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基（含X-α-gal）上生长并显色，而pGADT7-HbGPPS2和pGBKT7-HbGPPS2共转化的酵母菌和阴性对照无法在SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基（含X-α-gal）上生长并显色，表明HbGPPS1自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体，而HbGPPS2蛋白自身不能形成二聚体。

3 讨论

橡胶树的乳管细胞是能够特异合成顺式天然高分子橡胶的特化组织细胞，其内含物胶乳中含有大量的高分子天然橡胶和角鲨烯、γ-谷甾醇、β-豆甾醇、τ-杜松醇和（Z）-合金欢醇等小分子活性萜类物质，这些物质的合成均依赖于GPP前体的供应（Hao and Wu，2000;梅志刚等，2011），而GPP在GPPS催化作用下合成，即GPPS基因成为研究热点。目前，已从模式植物和非模式植物中克隆获得GPPS基因（Bouvier et al.，2000;于盱等，2013;Rai et al.，2013;王彩云等，2014;屠李婵等，2017）。本研究发现，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白与大戟科木薯、麻风树和蓖麻GPPS蛋白的同源性较高，亲缘关系较近，与橡胶草TkGPPS1和长春花CrGPPS2同源性亦较高，推测其具有相似功能。据前人研究报道，很多植物GPPS含有典型的异戊烯基转移酶活性结构域，该结构域含有2个富含Asp的基序FARM（DDXXDD）和SARM（DDXXD）（Rai et al.，2013），推测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白具有异戊烯基转移酶活性，属于植物GPPS家族成员。已有研究表明，GPPS具有多细胞器分布的特性，其在线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和胞质中均有分布（Bouvier et al.，2000;Rai et al.，2013）。本研究亚细胞定位结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2蛋白定位在叶绿体和线粒体，与拟南芥（Bouvier et al.，2000）和长春花（Rai et al.，2013）的GPPS亚细胞定位结果相同。但该预测结果未揭示GPPS是否能定位在橡胶粒子上，可能是由于WOLF PSORT和TargetP 1.1中缺乏橡胶粒子等特化亚细胞器的定位数据，因此，该预测结果仍需进一步验证。此外，本研究通过酵母双杂交试验发现，HbGPPS1自身及其与HbGPPS2间能形成较弱相互作用的二聚体，与其他植物的GPPS形成的二聚体类似（Bouvier et al.，2000;Buke and Croteau，2002;van Schie et al.，2007;Rai et al.，2013），表明橡胶树HbGPPS1和HbGPPS2可能在蛋白质水平上相互调控，但具体调控机制仍需进一步研究。

本研究qRT-PCR检测结果显示，HbGPPS1和HbGPPS2基因在树皮和胶乳中高丰度差异性表达，说明HbGPPS1和HbGPPS2基因的功能被精细调控，可能与其在胶乳和树皮中参与调控GPP合成的功能相适应。橡胶树乳管细胞被割破后释放部分胶乳，促进其内含物天然橡胶和萜类等活性物质的重新合成，在该再生过程中，HbGPPS1和HbGPPS2基因在开割树胶乳中的表达量较未开割树高，说明HbGPPS1和HbGPPS2基因的上调表达有助于促进天然橡胶与萜类物质的合成。据文献报道，割胶可激活乳管细胞内源茉莉酸信号从而促进天然橡胶生物合成（Deng et al.，2018）。本研究发现，橡胶树1年生萌条被MeJA处理后，HbGPPS1和HbGPPS2基因呈上调表达，表明外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成，激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达，促进内源茉莉酸的合成。虽然乳管细胞茉莉酸信号组分COI1-JAZ3-MYC2已被分离鉴定（Deng et al.，2018），但HbGPPS1和HbGPPS2基因是否是该组分的直接靶标有待进一步验证。

已有研究表明，不同橡胶树品系间存在明显的生理差异，在正常割胶条件下（未进行乙烯利刺激），不同橡胶树品系干胶含量依次为：PR107>热研7-20-59>RRIM600>热研7-33-97（魏芳和校现周，2008;吴明等，2013）。本研究发现，不同品系的HbGPPS2基因表达水平排序为：PR107>热研7-20-59>RRIM600>热研7-33-97>热研8-79，与黄德宝等（2010）的研究结论即热研7-33-97的总固形物含量（包括大量干胶和少量固形物质）高于热研8-79相对应，说明HbGPPS2基因的表达水平可能与干胶含量正相关。本研究还发现，不同品系胶乳中的HbGPPS2基因表达量显著高于HbGPPS1基因，说明HbGPPS2基因可能是参与GPP合成的主效基因，而HbGPPS1基因可能是参与GPP合成的功能冗余基因。现实生产中，橡胶总产量不仅与品系的干胶含量相关，还与其排胶量相关，虽然HbGPPS1和HbGPPS2基因在PR107中的表达量最高，但PR107的排胶量较低，橡胶总产量低于其他品系。热研7-33-97的干胶含量低于PR107，但其排胶量高于PR107，最终导致橡胶产量高于PR107。因此，HbGPPS2和HbGPPS1基因若用作橡胶树早期橡胶产量评价的分子标记，其表达量的高低只可能与橡胶干胶含量相关，用于橡胶产量评价时还需综合考虑特定品种的排胶量特性。

4 结论

橡胶树HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因，而HbGPPS1可能是功能冗余基因。HbGPPS2基因可用作不同橡胶树品系干胶含量评价的筛选标记。

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