EGTA结合热处理对香蕉果实CBF冷应答途径相关基因表达的影响

王海波 李璐 苏新国 张昭其

摘要：【目的】探討EGTA[乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸]结合热处理对香蕉果实CBF冷应答途径相关基因表达的影响，为研究热处理提高香蕉果实抗冷性的机理提供理论参考。【方法】分别采用热处理（HWD）和EGTA结合热处理（EGTA+HWD）两种方法处理香蕉果实，将处理的香蕉果实置于20 ℃恒温箱中贮藏3.0 h，然后置于7 ℃恒温箱中冷藏120.0 h，期间定期采集香蕉果皮，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20和7 ℃下不同取样时间点的表达情况。【结果】HWD处理的香蕉果实MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20 ℃贮藏0.5 h时表达量迅速升高，之后又迅速降低，7 ℃冷藏下这4个基因的表达量整体上呈升高趋势。与HWD处理相比，EGTA+HWD处理明显抑制MaDREB1D基因在20 ℃贮藏0.5 h时的表达，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏过程中的表达量;EGTA+HWD处理的MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在20 ℃贮藏和7 ℃冷藏中的表达量一直维持在较低水平。【结论】EGTA能抑制香蕉果实CBF冷应答途径相关基因的表达，推测钙信号参与香蕉果实CBF冷应答途径。

关键词： 香蕉;EGTA;热处理;CBF冷应答途径;基因;表达分析

中图分类号： S668.109.3                         文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2136-05

Effects of EGTA combined with heat treatment on expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit

WANG Hai-bo1， LI Lu2， SU Xin-guo1， ZHANG Zhao-qi3

（1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou  510520; 2College of Biotechnology， South China Agricultural University，Guangzhou  510642; 3College of Horticulture， South China Agricultural

University， Guangzhou  510642）

Abstract：【Objective】The effects of ethylene glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N，N-tetraacetic acid（EGTA） combined with heat treatment on gene expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit were explored to provide theoretical reference for studying the mechanism of heat treatment promoting cold resistance of banana fruit. 【Method】Banana fruits were treated by heat treatment（HWD） and EGTA combined with heat treatment（EGTA+HWD） respectively. The treated banana fruits were stored at 20 ℃ for 3.0 h in incubator，then stored at 7 ℃ for 120.0 h. Banana peels were collected regularly during the storage period. Analysis of the four genes（MaDREB1D， MaDREB2C， MaDREB3 and MaCOR413） expression patterns at 20 and 7 ℃ in banana fruit were conducted using real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】The expression of these four genes in banana fruits was enhanced rapidly after HWD treatment at 0.5 h（20 ℃）， and decreased rapidly later. The expression of these four genes was enhanced by HWD treatment at 7 ℃ in varying degrees. Compared with HWD treatment，EGTA+HWD treatment inhibited the expre-ssion of MaDREB1D at 20 ℃ 0.5 h and reduced the expression of MaDREB1D at 7 ℃ in cold storage. The expression of three genes of MaDREB2C， MaDREB3 and MaCOR413 treated by EGTA+HWD at 20 ℃ and 7 ℃ remained at a low level. 【Conclusion】EGTA inhibits the expression of CBF cold response pathway related genes in banana fruit. It is speculated that calcium signaling may be involved in the regulation of CBF cold response pathway in banana fruit.

Key words： banana; EGTA; heat treatment; CBF cold response pathway; gene; expression analysis

0 引言

【研究意义】香蕉果实属冷敏性水果，是研究果实冷害的良好材料（陆旺金等，1999;张昭其和庞学群，2008）。热处理是提高果蔬抗冷性的有效措施，但热处理诱导的抗冷机制尚未清楚，且采后果实中钙信号与CBF（C-repeat binding transcription factor）冷应答途径是否协同参与热处理诱导的抗冷性也不明确。因此，研究EGTA[乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸]结合热处理对香蕉果实CBF冷应答途径相关基因表达的影响，进而探索提高香蕉果实抗冷性的方法，对促进香蕉产业发展具有重要意义。【前人研究进展】CBF/DREB（C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor）冷应答途径是诱导植物产生抗冷性的最重要途径。热处理可通过诱导CBF冷应答途径相关基因表达上调以提高果实的抗冷性，如猕猴桃果实经35或45 ℃热处理10 min后显著提高果实AcCBF基因的表达量，可使果实能在0 ℃下冷藏90 d，且有效减轻果实的冷害症状（Ma et al.，2014）。钙信号也可调控CBF冷应答途径，如含有CaM结合位点的转录因子CAMTA/SR能正调控CBFs基因的表达，从而提高植物的抗冷性（Peng et al.，2015;Wang et al.，2016）。此外，Doherty等（2009）研究发现，拟南芥CAMTA3能与CBF2启动子区域CM2序列（CCGCGT）结合，从而激活CBF2等基因的表达。目前，有关Ca2+螯合剂EGTA对植物CBF冷应答途径基因影响的研究报道较少。于涌鲲等（2010）采用0.5～6.0 mmol/L EGTA和A23187（Ca2+载体，增加Ca2+浓度）处理菠菜幼苗时发现，EGTA浓度越高，CBFs表达量越少。窦海鸥（2014）采用EGTA处理马铃薯幼苗后AtCBF3基因的表达显著下调，利用CaCl2处理则显著上调AtCBF3基因的表达，说明钙信号可能参与调控CBF冷应答途径。【本研究切入点】至今，鲜见有关EGTA结合热处理对香蕉果实CBF冷应答途径相关基因表达影响的研究报道。【拟解决的关键问题】分别采用热处理（HWD）和EGTA结合热处理（EGTA+HWD）两种方法处理香蕉果实，将处理的香蕉果实置于20 ℃恒温箱中贮藏3.0 h，然后置于7 ℃恒温箱中冷藏120.0 h，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同时间点MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因在香蕉果皮中的表达模式，探索钙信号是否参与调控香蕉果实CBF冷应答途径，为研究热处理诱导香蕉果实产生抗冷性的机理提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试香蕉品种为巴西，种植于广州市番禺香蕉园。反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix试剂盒购自TOYOBO公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品处理及采集 采集饱满度七八成的绿熟香蕉，从中挑选无机械损伤、无病虫害、大小均匀的单个香蕉，先后用0.1%漂白粉和0.05%施保功浸泡5 min，晾干备用。热处理（HWD处理）：将香蕉果实装在塑料框中加盖，果实带框浸入52 ℃热水处理机（容积400 L）中3 min，捞出晾干备用。EGTA结合HWD处理（EGTA+HWD处理）：热处理后的果实立即放入含有50 mmol/L EGTA的干燥器中浸泡，真空泵抽真空渗透15 min，恢复常压5 min，晾干备用。

HWD处理和EGTA+HWD处理后的香蕉果实放入20 ℃恒温箱中贮藏3.0 h，然后置于7 ℃恒温箱中冷藏120.0 h，期间定期采集果皮。取样时间点：20 ℃下0（T1）、0.5（T2）、1.5（T3）和3.0 h（T4）;7 ℃下1.0（T5）、4.0（T6）、8.0（T7）、24.0（T8）、48.0（T9）和120.0 h（T10）。每个时间点设3个重复。

1. 2. 2 引物设计 从香蕉基因组数据库中搜索获得4个CBF冷应答途径相关的基因序列（MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413），利用Primer 5.0设计qRT-PCR引物（表1）。

1. 2. 3 总RNA提取及cDNA第一链合成 采用热硼酸法从香蕉果皮中提取总RNA（He，2012），以1%琼脂糖凝胶电泳检测其提取质量。挑选完整片段的香蕉果皮总RNA为模板，参照反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。

1. 2. 4 qRT-PCR檢测 采用THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix对上述处理样品的MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因进行qRT-PCR检测。反应体系20.00 μL：cDNA模板2.00 μL， SYBR-Green PCR Master Mix 10.00 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.25 μL，ddH2O补足至20.00 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环。利用熔解曲线分析扩增产物的熔解温度（Tm，65～95 ℃）。以Actin1为内参基因（Chen et al.，2011），MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因的相对表达量均利用2-△△Ct法进行计算。

1. 3 统计分析

试验数据采用Sigmaplot 12.5进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取结果

从HWD处理和EGTA+HWD处理的香蕉果皮中提取总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。总RNA中18S和28S条带清晰可见，无明显拖尾现象，说明采用热硼酸法提取的总RNA纯度较高、质量较好，无明显降解。用超微量分光光度计测定所有样品的总RNA紫外吸收值（A260/A280）为1.80～2.00，进一步说明RNA质量较好，可用于后续定量表达分析。

2. 2 HWD处理和EGTA+HWD处理对香蕉果实MaDREB1D基因表达的影响

从图2可知，HWD处理的MaDREB1D基因表达量在20 ℃ 0.5 h（T2）时迅速升高，之后迅速下降至其表达量的50%左右，当香蕉果实转入7 ℃下冷藏时，MaDREB1D基因的表达量呈升—降—升的变化趋势。与HWD相比，EGTA+HWD处理明显抑制MaDREB1D基因在20 ℃ 0.5 h（T2）时的表达，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏过程中的表达量。除7 ℃ 8.0 h（T7）外，EGTA+HWD处理的MaDREB1D基因表达量均低于HWD处理。 HWD处理在7 ℃ 8.0 h（T7）时，MaDREB1D基因的表达量突然下降，究其原因可能是MaDREB1D基因在7 ℃ 4.0 h前表达被诱导增强，需要一段时间恢复，后期香蕉果实出现冷害症状从而再次诱导MaDREB1D基因的表达量逐渐上升。可见，EGTA可抑制由热处理诱导的香蕉果实MaDREB1D基因上调表达。

2. 3 HWD处理和EGTA+HWD处理对香蕉果实MaDREB2C基因表达的影响

从图3可知， HWD处理的MaDREB2C基因表达量在20 ℃ 0.5 h（T2）和7 ℃ 24.0 h（T8）时各出现一个高峰，其他时间点则维持在较低水平。而EGTA+HWD处理的MaDREB2C基因表达量仅在7 ℃ 48.0 h（T9）出现一个小高峰，其余时间点的表达量与20 ℃ 0 h（T1）差异不明显。总体来看，在7 ℃ 1.0 h（T5）、48.0 h（T9）和120.0 h（T10）时，HWD处理和EGTA+HWD处理的MaDREB2C基因表达量基本一致，其他时间点EGTA+HWD处理的MaDREB2C基因表达量均较HWD处理低。可见，EGTA可抑制由热处理诱导的香蕉果实MaDREB2C基因上调表达，并使其表达量一直维持在较低水平。

2. 4 HWD处理和EGTA+HWD处理对香蕉果实MaDREB3基因表达的影响

从图4可知，HWD处理的MaDREB3基因表达量在7 ℃ 1.0 h（T5）时出现一个高峰，其余时间点均保持较低水平，而EGTA+HWD处理的MaDREB3基因表达量一直处于较低水平。总体来看，EGTA+HWD处理的MaDREB3基因表达量在大部分时间点均低于HWD处理。综上所述，EGTA可抑制由热处理诱导的香蕉果实MaDREB3基因上调表达，并使其表达量一直维持在较低水平。

2. 5 HWD处理和EGTA+HWD处理对香蕉果实MaCOR413基因的影响

从图5可知，HWD处理的MaCOR413基因表达量在20 ℃ 0.5 h（T2）和7 ℃ 4.0 h（T6）时分别出现一个高峰，其他时间点则维持在较低水平;EGTA+HWD处理的MaCOR413基因表达量则一直维持在较低水平，且除20 ℃ 1.5 h（T3）和7 ℃ 120.0 h（T10）外，其他时间点均低于HWD处理。可见，EGTA可抑制由热处理诱导的香蕉果实MaCOR413基因上调表达，并使其表达量一直维持在较低水平。

3 讨论

CBF冷应答途径是植物产生抗冷性的主要信号转导途径。受ICE（Inducer of CBF expression）调控的CBF能特异结合启动子中含CRT/DRE的顺式元件，激活下游一系列冷调节基因COR的表达，从而提高植物的抗寒性（Hadi et al.，2011;Wu et al.，2012;Chen et al.，2013）。拟南芥基因组CBF/DREB亚族分为6个亚类（A1～A6），本研究的MaDREB1D、MaDREB2C和MaDREB3基因分别属于CBF/DREB转录因子A6、A3和A4亚类。

前人研究表明，热处理是提高采后果实抗冷性的有效手段，如52 ℃热处理香蕉果实3 min能有效减轻香蕉果实的冷害症状（Wang et al.，2008，2012;王海波等，2012）。本研究結果表明，热处理后20 ℃贮藏0.5 h时香蕉果实MaDREB1D、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因上调表达，当香蕉果实在7 ℃冷藏时，这4个基因受热处理诱导其表达量均不同程度上升。在其他采后果蔬中也有类似研究报道，如热处理能诱导玉米ZmDREB2A基因（Qin et al.，2007）和苹果MsDREB2C基因（Zhao et al.，2013）的表达上调;35或45 ℃热处理均能显著提高猕猴桃果实AcCBF基因的表达量（Ma et al.，2014）。

本研究发现，与热处理相比，EGTA结合热处理能明显抑制香蕉果实在20 ℃贮藏时的MaDREB1D、MaDREB2C和MaCOR413基因表达，但对MaDREB3基因表达的抑制效果不明显;当香蕉果实转入7 ℃冷藏后，与热处理相比，EGTA结合热处理能明显抑制MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413基因的表达，使其表达量一直处于较低水平。与热处理相比，EGTA结合热处理明显抑制MaDREB1D基因在20 ℃ 0.5 h时的表达，也降低了MaDREB1D基因在7 ℃冷藏过程中的表达量。总之，EGTA有效抑制了香蕉果实CBF冷应答途径相关基因的表达。在其他作物中也有类似报道，窦海鸥（2014）用20 mmol/L EGTA和40 ℃热激处理马铃薯幼苗能显著抑制AtCBF3基因的表达，利用100 mmol/L CaCl2和40 ℃热激处理马铃薯幼苗则能显著上调其AtCBF3基因的表达;于涌鲲等（2010）利用A23187和0.5～6.0 mmol/L EGTA处理菠菜幼苗能抑制其CBF基因表达，且EGTA处理浓度越高，CBF基因表达量越少;张国增等（2009）用20 mmol/L EGTA或10 mmol/L LaCl3处理拟南芥幼苗均能抑制4 ℃低温诱导的胞质Ca2+浓度升高，且CBF1超表达突变体和对照胞质中的Ca2+浓度下降至同一水平，说明Ca2+参与拟南芥CBF1冷应答途径，CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca2+浓度来提高植物的抗冷性。以上研究结果均说明钙信号参与了CBF冷应答途径。

4 結论

EGTA能抑制香蕉果实CBF冷应答途径相关基因的上调表达，推测钙信号可能参与香蕉果实CBF冷应答途径。

参考文献：

窦海鸥. 2014. AtCBF3提高转基因马铃薯耐热性的研究[D]. 泰安：山东农业大学. [Dou H O. 2014. Arabidopsis tha-liana CBF3 enhances the tolerance of potato to high temperature[D]. Taian：Shandong Agricultural University.]

陆旺金，张昭其，季作梁. 1999. 热带亚热带果蔬低温贮藏冷害及御冷技术[J]. 植物生理学通讯，35（2）：158-163. [Lu W J，Zhang Z Q，Ji Z L. 1999. Chilling injury and approaches to reduce chilling injury of tropical and subtropical fruits and vegetables during low temperature storage[J]. Plant Physiology Communications，35（2）：158-163.]

王海波，庞学群，黄雪梅，张昭其. 2012. 活性氧在热处理诱导香蕉耐冷性中的作用[J]. 中国农业科学，45（5）：936-942. [Wang H B，Pang X Q，Huang X M，Zhang Z Q. 2012. The role of reactive oxygen species in heat treatment-induced chilling tolerance in banana fruit[J]. Scientia Agricultura Sinica，45（5）：936-942.]

于涌鲲，赵福宽，万善霞，郝玉兰，孙清鹏. 2010. Ca2+和茉莉酸对菠菜CBF表达的影响[J]. 中国农学通报，26（21）：59-62. [Yu Y K，Zhao F K，Wan S X，Hao Y L，Sun Q P. 2010. Effect of calcium and jasmonic acid on the expre-ssion of CBF in spinach[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，26（21）：59-62.]

张国增，白玲，宋纯鹏. 2009. 低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化[J]. 植物学报，44（3）：283-289. [Zhang G Z，Bai L，Song C P. 2009. Intracellular Ca2+ changes during cold stress in CBF1-overexpress Arabidopsis[J]. Chinese Bulletin of Botany，44（3）：283-289.]

张昭其，庞学群. 2008. 南方水果贮藏保鲜技术[M]. 南宁：广西科学技术出版社. [Zhang Z Q，Pang X Q. 2008. Technique of Postharvest Handling and Storage of Fruits in Southern China[M]. Nanning：Guangxi Science and Technology Press.]

Chen L，Zhong H Y，Kuang J F，Li J G，Lu W J，Chen J Y. 2011. Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions[J]. Planta，234（2）：377-390.

Chen Y，Chen Z L，Kang J Q，Kang D M，Gu H Y，Qin G J. 2013. AtMYB14 regulates cold tolerance in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology Reporter，31（1）：87-97.

Doherty C J，Buskirk H A V，Myers S J，Thomashow M F. 2009. Roles for Arabidopsis CAMTA transcription factors in cold-regulated gene expression and freezing tolerance[J]. Plant Cell，21（3）：972-984.

Hadi F，Gilpin M，Fuller M P. 2011. Identification and expre-ssion analysis of CBF/DREB1 and COR15 genes in mutants of Brassica oleracea var. botrytis with enhanced praline production and frost resistance[J]. Plant Physiology and Biochemistry，49（11）：1323-1332.

He L H，Chen J Y，Kuang J F，Lu W J. 2012. Expression of three sHSP genes involved in heat pretreatment-induced chilling tolerance in banana fruit[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，92（9）：1924-1930.

Ma Q S，Suo J T，Hube D J，Dong X Q，Han Y，Zhang Z K，Rao J P. 2014. Effect of hot water treatments on chilling injury and expression of a new C-repeat binding factor（CBF） in ‘Hongyang kiwifruit during low temperature storage[J]. Postharvest Biology and Technology，97（1）：102-110.

Peng X，Wu Q，Teng L，Tang F，Pi Z，Shen S H. 2015. Transcriptional regulation of the paper mulberry under cold stress as revealed by a comprehensive analysis of transcription factors[J]. BMC Plant Biology，15（1）：1-14.

Qin F，Kakimoto M，Sakuma Y，Maruyama K，Osakabey，Tran L S，ShinozakiK，Yamaguchishinozaki K. 2007. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L[J]. The Plant Journal，50（1）：54-69.

Wang H B，Zhang Z Q，Huang X M，Jiang Y M，Pang X Q. 2008. Hot water dipping induced chilling resistance of harvested banana fruit[J]. Acta Horticulturae，804（1）：513-522.

Wang H B，Zhang Z Q，Xu L Y，Huang X M，Pang X Q. 2012. The effect of delay between heat treatment and cold storage on alleviation of chilling injury in banana fruit[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，92（13）：2624-2629.

Wang X，Wu D，Yang Q，Zeng J，Jin G，Chen Z H，Zhang G P，Dai F. 2016. Identification of mild freezing shock response pathways in barley based on transcriptome profi-ling[J]. Frontiers in Plant Science，7（1）：106-119.

Wu L H，Zhou M Q，Shen C，Liang J，Lin J. 2012. Transgenic tobacco plants over expressing cold regulated protein CbCOR15b from Capsella bursa-pastoris exhibit enhanced cold tolerance[J]. Journal of Plant Physiology，169（14）：1408-1416.

Zhao K，Shen X J，Yuan H Z，Liu Y，Liao X，Wang Q，Liu L L，Li F，Li T H. 2013. Isolation and characterization of dehydration responsive element-binding factor 2C（MsDREB2C） from Malus sieversii Rome[J]. Plant and Cell Physiology，54（9）：1415-1430.