不同产地葡萄花青素提取物的HPLC特征图谱构建及其生物活性分析

谭西 王馨悦 周欣 陈华国

摘要：【目的】對富含花青素的巨峰葡萄提取物指纹图谱进行测定并构建其特征图谱，考察不同产地巨峰葡萄提取物的抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性及α-淀粉酶抑制活性，研究巨峰葡萄花青素的谱—效关系，明确其结构与生物活性规律，为富含花青素植物资源的开发与利用提供参考依据。【方法】以12个产地巨峰葡萄为研究对象，对其进行花青素提取，检测提取物的指纹图谱并构建特征图谱，综合评价不同产地样品的抗氧化活性、AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性，并对其进行谱—效关系研究。【结果】确定9、12、21、50和55号5个峰为巨峰葡萄的指纹图谱特征峰。12个产地的巨峰葡萄花青素含量差异显著（P<0.05，下同），以山东产地的含量最高（3.93 mg/g），湖北产地的最低（0.13 mg/g）。福建产地的巨峰葡萄提取物抗氧化能力最强，其对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力显著强于其他产地的巨峰葡萄;山东产地巨峰葡萄提取物的AChE抑制活性最强（抑制率33.6%），其次是福建产地;浙江产地巨峰葡萄提取物的α-淀粉酶抑制活性最强，其次是新疆产地，内蒙古产地的抑制活性最弱。谱—效关系分析结果表明，DPPH和ABTS法均可用于评价巨峰葡萄提取物抗氧化活性，5个特征峰与生物活性有较强的关联性，其中12、21和50号峰与其抗氧化活性呈显著或极显著（P<0.01）相关，9、21和55号峰对α-淀粉酶抑制活性有一定贡献，12、21和50号峰对AChE抑制活性具有较大贡献。【结论】富含花青素的巨峰葡萄提取物具有良好的抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性和AChE抑制活性，可作为抗氧化、预防治疗高血糖和阿尔茨海默病的潜在物质。

关键词： 巨峰葡萄;花青素;特征图谱构建;生物活性;谱—效关系

中图分类号： S663.1;TS209                        文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2263-10

Construction of HPLC characteristic chromatogram and bioactivity of anthocyanin extracts in Kyoho grape from different areas

TAN Xi1，2，3， WANG Xin-yue1，2，3， ZHOU Xin1，2，3 ， CHEN Hua-guo1，2，3*

（1Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guizhou Normal University， Guiyang  550001， China; 2Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control & Evaluation Technology of Medicine， Guizhou Normal University， Guiyang  550001， China; 3Research Center for Quality Control of Natural Medicine， Guizhou Normal University， Guiyang  550001， China）

Abstract：【Objective】The fingerprint chromatogram of anthocyanin-rich Kyoho grape（Vitis vinifera L.×V. labrusca Kyoho） extract was determined and its characteristic chromatogram was constructed. The antioxidant activity，acetylcholinesterase（AChE） inhibitory activity and α-amylase inhibitory activity of Kyoho grape extract from different habitats were investigated. The spectrum-activity relationship of anthocyanins from Kyoho grape was studied in order to explore its structure and biological activity regulation，and to provide reference for the development and utilization of anthocyanin-rich plant resources. 【Method】Taking Kyoho grapes from 12 different areas as research objects，anthocyanins were extrac-ted，fingerprints of extracts were detected and characteristic chromatogram were constructed. Antioxidant activity， AChE inhibitory activity and α-amylase inhibitory activity of the samples from different areas were evaluated comprehensively. Finally，the spectrum-effect relationship was studied. 【Result】The five peaks of No. 9，12，21，50 and 55 were identified as the characteristic peaks of Kyoho grapes fingerprints chromatogram .The anthocyanin contents of Kyoho grape from 12 producing areas were significantly different（P<0.05，the same below）. The highest anthocyanin content was found in Shandong origin（3.93 mg/g） and the lowest in Hubei origin（0.13 mg/g）. The antioxidant activity of Kyoho grape extract from Fujian origin was the strongest，and its scavenging ability to DPPH and ABTS free radicals was significantly stronger than that of Kyoho grape from other areas.The AChE inhibitory activity of Kyoho grape extract from Shandong origin was the strongest （inhibition rate was 33.6%），followed by Fujian origin.The inhibitory activity of α-amylase of Kyoho grape extract from Zhejiang origin was the strongest，those from Xinjiang and Inner Mongolia origins were the weakest.Spectrum-effect relationship analysis showed that DPPH and ABTS methods could be used to evaluate the antioxidant activity of Kyoho grape extract， and the five characteristic peaks had strong correlation with biological activity. Among them，peaks No. 12，21 and 50 were significantly or extremely（P<0.01） correlated with their antioxidant activities，peaks No. 9， 21 and 55 contributed to the inhibitory activity of α-amylase，and peaks No. 12，21 and 50 contributed greatly to the inhibitory activity of AChE. 【Conclusion】Anthocyanin-rich Kyoho grape extract has fine antioxidant activity，α-amylase inhibitory activity and AChE inhibitory activity. It can be used as a potential substance for antioxidation， prevention and treatment of hypoglycemia and Alzheimer's disease.

Key words：Kyoho grape;anthocyanin;characteristic chromatogram construction; biological activity;spectrum-effect relationships

0 引言

【研究意義】花青素是一类含有多种酚羟基的黄酮类化合物，广泛分布于植物的根、茎、叶、花及果实组织中（孙建霞等，2008）。研究表明，花青素具有抗氧化、抗炎抗菌、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、降血糖等药用功效（徐春明等，2013，陈华国等，2018），因来源广泛、细胞毒性小及食用安全等特点而广受国内外相关科技研究者的关注。葡萄（Vitis vinifera L.）是一种富含花青素（矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷等）的水果（Cassidy et al.，2013），对比不同产地同一品种葡萄中花青素提取物的生物活性，分析指标间的谱—效关系，对开发和利用富含花青素的植物资源具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有一些关于葡萄花青素的研究，主要集中在提取分离纯化、抗氧化活性及组分鉴定方面。Frenich等（2010）利用高效液相色谱（HPLC）成功从葡萄皮中提取鉴定了3-O-葡萄糖苷。杨慧等（2015）以新疆紫葡萄为试验材料，研究发现超声波辅助乙醇法提取花青素较传统乙醇浸提法平均提取率提高20.5%。杜月娇等（2017）发现山葡萄花青素主要由飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、芍药素及锦葵素组成，其含量分别为51.03、19.30、13.54、3.00和99.91 mg/100 g。葛艳琳（2018）研究发现，山葡萄皮花青素浓度与其对DPPH自由基的清除能力呈正相关，且抗氧化活性高于抗坏血酸。Kharadze等（2018）对5个地方葡萄品种的红葡萄酒样品进行花青素研究，发现葡萄酒花青素含量与其抗氧化活性呈正相关。MohdMaidin等（2018）研究发现表面活性剂TWEEN20对红葡萄渣花青素提取物具有稳定作用。【本研究切入点】虽然已有关于葡萄花青素的研究，但其研究内容与形式较单一，对体外降血糖（α-淀粉酶抑制活性）、改善心脑血管疾病功能[乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性]及探索富含花青素提取物的谱—效关系研究较少，且大多研究局限于某产地的某种样品，缺乏可比性、系统性和科学性。本研究以来自不同省（市）富含花青素的巨峰葡萄为研究对象开展相关研究，比以往的单一研究形式有所突破。【拟解决的关键问题】构建巨峰葡萄富含花青素提取物的特征图谱，对比不同产地巨峰葡萄富含花青素提取物的抗氧化活性、AChE抑制活性及α-淀粉酶抑制活性，分析各指标间的谱—效关系，以期为富含花青素植物资源的开发与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

巨峰葡萄（V. vinifera L.×V. labrusca Kyoho）分别购自北京市、广东（广州）、山东（济宁）、新疆（乌鲁木齐）、重庆市、浙江（杭州）、福建（福州）、四川（成都）、内蒙古（呼和浩特）、湖北（武汉）、江西（南昌）和贵州（贵阳）。无水乙醇（分析纯）购自天津市富宇精细化工有限公司;甲醇和盐酸（优级纯）购自国药集团化学试剂有限公司;磷酸氢二钾和磷酸二氢钾（分析纯）购自天津博迪化工股份有限公司;乙腈（色谱纯）购自美国Tedia公司;冰乙酸和可溶性淀粉（分析纯）购自天津市致远化学试剂有限公司;甲酸（分析纯）购自重庆茂业化学试剂有限公司;矢车菊-3-O-葡萄糖苷（纯度≥99%）和维生素C（纯度≥99%）购自贵州迪大科技有限责任公司;2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（纯度≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（纯度≥98%）和5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）（纯度≥98%）均购自美国Sigma公司;α-淀粉酶（分析纯）、二硝基水杨酸（纯度>98%）、酒石酸钾钠（纯度>98%）、AChE（纯度≥99%）和碘代硫代乙酰胆碱（ATCI）（纯度≥99%）均购自大连美仑生物技术有限公司。

主要仪器设备：明澈纯水/超纯水系统（法国Millipore公司），Spectra Max Plus 384酶标仪（美国Molecular Device公司），XS 105十万分之一分析天平、AL 204万分之一分析天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]，R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），Eppendorf Research Plus微量移液器（德国Eppendorf公司），TD5M低速离心机（长沙迈佳森仪器设备有限公司），三洋微波炉EM-202MS1（合肥荣事达三洋电器有限公司），美的搅拌机MJ-220BP01A（广东美的生活电器制造有限公司），Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），Hypersil GOLD C18柱（美国Thermo Scientific）。

1. 2 花青素提取物制备

1. 2. 1 花青素提取 在本课题组前期研究的基础上，参照Wen等（2015）的方法略作修改，将12个产地巨峰葡萄各自粉碎匀浆后，以料液比1∶10加入52%乙醇溶液，微波提取4 min（微波功率469 W），提取液于低速离心机3500 r/min离心5 min后取上清液减压浓缩，冷冻干燥后制成浸膏，置于干燥罐中存放备用。

1. 2. 2 花青素纯化 参照本课题组前期研究（Wen et al.，2016），将花青素提取物加水稀释至花青素质量浓度为0.75 mg/mL，用盐酸调节pH至1。聚酰胺树脂（60～100目）用95%乙醇煮沸4 h后以纯水洗净，作为填料装柱，将稀释后的样品提取物以5 BV/h的速度上柱5 BV，随后用3 BV纯水洗脱，再用80%乙醇（pH 3）以5 BV/h的速度洗脱3.5 BV，洗脱液经减压浓缩后真空冷冻干燥得样品粉末，装于棕色瓶保存在干燥器中。

1. 3 样品溶液配制

1. 3. 1 样品储备液配制 精确称取各样品浸膏置于4 mL离心管中，加入适量水复溶，配制成母液质量浓度40 mg/mL的储备液，存放于-20 ℃，使用时稀释。

1. 3. 2 HPLC供试品溶液制备 准确量取各样品储备液，加入适量纯水，稀释后冷却至室温，HPLC进样前用0.45 μm水相微孔滤膜过滤，取续滤液，即得HPLC供试品溶液。

1. 3. 3 对照品溶液制备 准确称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品4.47 mg，加入适量纯水溶解，冷却至室温，定容至5 mL，配制所得对照品质量浓度为0.897 mg/mL，上样前通过0.45 μm水相微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。

1. 4 色谱条件

色谱柱Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为1%甲酸，B为乙腈，柱温35 ℃，检测波长290 nm，进样量20.0 μL，梯度洗脱程序见表1。

1. 5 方法学考察

通过预试验发现，山东产地的巨峰葡萄花青素含量相对较高，且图谱情况效果较佳，故以山东巨峰葡萄为HPLC指纹图谱方法学考察的试验对象。

1. 5. 1 精密度考察 取80.00 mg山东巨峰葡萄样品，加入4 mL纯水溶解，制成供试品溶液进行分析，按1.4的色谱条件连续进样5次，检测得到液相色谱图，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD，%），以确保仪器的精密度。

1. 5. 2 稳定性考察 取80.00 mg山东巨峰葡萄样品，加入4 mL纯水溶解，制成供试品溶液进行分析，分别在0、3、6、12和24 h进样，检测得到液相色谱图，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，测定该样品的稳定性。

1. 5. 3 重复性考察 准确称取80.00 mg山东巨峰葡萄样品5份，分别加入4 mL纯净水溶解，制成供试品溶液进行分析，检测得到液相色谱图，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，测定分析方法重复性。

1. 6 样品指纹图谱测定

按照1.3制备供试品溶液，于Agilent 1260高效液相色譜仪精密上样20 μL，以1.4的条件测定，得到不同样品的液相色谱图。将11个产地（因湖北产地的花青素含量太低，故舍去其指纹图谱研究）巨峰葡萄HPLC图谱的数据导入中药色谱特征图谱相似度评价系统（2004A版），设置参比峰、时间窗后进行自动化匹配及相似度计算，得到各产地样品测定的指纹图谱。

1. 7 特征图谱构建

通过中药色谱特征图谱相似度评价系统（2004A版）确定各样品的共有特征峰，构建各样品的花青素高效液相特征图谱。

1. 8 相似度评价

通过中药色谱特征图谱相似度评价系统（2004A版）进行相似度评价。

1. 9 花青素含量测定

采用盐酸—甲醇法测定花青素含量。取1 mL花青素样品溶液（以溶剂为空白）加入到10 mL比色管中，再加入5 mL 1%盐酸甲醇溶液使其显色，充分振荡摇匀，50 ℃水浴10 min，取出冷却至室温，于530 nm处测定其吸光值。按上述条件以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为对照品，测定对照品530 nm处吸光值。根据计算公式计算样品中的花青素含量。

Cs=[AsAc]×Cc

式中，Cs表示样品质量浓度，As表示样品吸光值，Cc表示对照品质量浓度，Ac表示对照品吸光值。

1. 10 抗氧化活性能力测试

1. 10. 1 ABTS自由基清除能力测试 ABTS自由基溶液由14 mmol/L ABTS溶液和5 mmol/L过硫酸钾水溶液以1∶1混合避光反应12～16 h后使用，使用时20倍稀释。样品溶液（Ai）的制备，分别取50 μL不同产地的相同浓度样品溶液加至酶标板中，复孔3次，再加入200 μL ABTS自由基溶液混合均匀，室温避光反应6 min，于734 nm处测定吸光值。以200 μL纯净水代替ABTS溶液为对照（Aj）测定吸光值，空白（A0）以相同体积纯水代替样品溶液，以维生素C为对照品，根据计算公式计算样品ABTS自由基清除率。

清除率（%）=[（A0-Ai-Aj）A0]×100

以维生素C质量浓度（μg/mL）为横坐标、ABTS自由基清除率（%）为纵坐标，得到线性回归方程：y=1.2006x-0.3016（R2=0.9965）。

1. 10. 2 DPPH自由基清除能力测试 参考Kim等（2003）的方法略有改动进行DPPH自由基清除试验。称取9.86 mg DPPH溶于无水乙醇溶液，定容至100 mL，现配现用。取40 μL不同产地的相同浓度样品溶液加至酶标板中，复孔3次，再加入160 μL DPPH溶液，于37 ℃避光反应30 min，以乙醇为对照，在波长517 nm处测定吸光值，空白溶液以相同体积纯水代替样品溶液，计算样品DPPH自由基清除率（清除率计算公式参照ABTS自由基清除率计算公式）。以维生素C为对照品，维生素C质量浓度（μg/mL）为横坐标，以DPPH自由基清除率（%）为纵坐标，得到线性回归方程：y=1.2042x+1.7233（R2=0.9993）。

1. 11 AChE抑制活性测试

采用改良的Ellman法（Ellman et al.，1961）对富含花青素巨峰葡萄提取物进行AChE活性抑制研究。整个反应在酶标板中进行，反应体系中各加入20 μL样液、140 μL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）、20 μL AChE（0.64 μg/mL）和10 μL 75 mmol/L ATCI溶液，在37 ℃保温30 min后加入10 μL DTNB溶液，室温下避光放置20 min后立即在波长405 nm处测定吸光值（AUS）。52%乙醇代替样品溶液测得空白值（AUb）;磷酸缓冲液代替酶溶液的空白溶液吸光值（AU0），磷酸缓冲液代替酶溶液测定样品溶液的吸光值（AU0），以氢溴酸加兰他敏为阳性对照，试验重复3次，求平均值。AChE活性抑制率计算公式如下：

AChE抑制率（%）=[（AUb-AU0）-（AUS-AU0）AUb-AU0]×

100

1. 12 α-淀粉酶抑制活性测试

参考Marcia等（2009）的方法略作修改，取100 μL相同浓度、不同产地的巨峰葡萄供试品溶液置于4 mL离心管中，然后加入200 μL 1 mg/mL α-淀粉酶溶液，于恒温箱37 ℃保温10 min后加入400 μL 1%可溶性淀粉溶液，再于恒温箱37 ℃保温10 min，加入50 μL DNS溶液沸水浴5 min，置于冷水中迅速冷却至室温，于540 nm处测定吸光值，其中空白溶液以纯水代替样品。

α-淀粉酶抑制率（%）=[A0-ASA0]×100

式中，AS为样品组吸光值，A0为空白组吸光值，样品组与空白组均扣除相应的本底吸收值。

1. 13 谱—效关系分析

1. 13. 1 Pearson相关分析 根据不同产地提取物的特征图谱共有峰峰面积、花青素含量、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性，通过Pearson相关系数法建立6个变量间的关系，结果用Pearson系数表示。

1. 13. 2 灰色关联度分析 采用灰色关联度对不同产地样品的特征色谱峰峰面积和抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性、AChE抑制活性结果进行综合分析，揭示不同样品花青素与其生物活性的规律。

1. 13. 3 偏最小二乘法 采用偏最小二乘法对样品特征图谱峰面积与生物活性（特别是抗氧化活性）的相关性进行研究，分析特征图谱色谱峰与抗氧化作用的相互关系。

1. 14 统计分析

采用Excel 2016、SPSS 21.0、DPS V15.10和SIMCA 14.1对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 方法学考察结果

2. 1. 1 精密度考察 对山东巨峰葡萄供试品溶液检测分析后发现，其主要共有峰相对保留时間的RSD为0.10%～0.21%，主要共有峰相对峰面积的RSD为0.76%～2.34%，均小于3.00%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2. 1. 2 稳定性考察 对山东巨峰葡萄供试品溶液检测分析后发现，其主要共有峰相对保留时间的RSD为0.26%～0.32%，主要共有峰相对峰面积的RSD为0.73%～2.94%，符合指纹图谱要求，表明该供试品溶液在24 h内化学性质稳定。

2. 1. 3 重复性考察 对山东巨峰葡萄供试品溶液检测分析后发现，其共有峰相对保留时间的RSD为0.11%～0.19%，相对峰面积的RSD为0.51%～1.76%，均符合指纹图谱要求，表明该方法重现性良好。

2. 2 样品指纹图谱测定结果

以北京巨峰葡萄（S1）为参照图谱，采用中药色谱特征图谱相似度评价系统软件（2004A版），按照平均值生成对照图谱并设置时间窗为0.5进行自动匹配后生成指纹图谱（图1）。通过指纹图谱可比较出11个产地中巨峰葡萄含有的共有峰，以确定不同产地巨峰葡萄中可能含有的相同物质。

2. 3 特征图谱的构建

依照植物资源指纹图谱研究的技术要求及相似度评价系统构建巨峰葡萄提取物的特征图谱（图2），通过比较发现，在11个产地巨峰葡萄提取物指纹图谱中，9、12、21、50和55号峰为共有且相对较高的峰，因此，最终选择这5个峰作为巨峰葡萄的指纹特征峰，峰面积及保留时间见表2。

2. 4 相似度评价结果

由表3可知，11个产地的巨峰葡萄提取物色谱图与对照指纹谱图的相似度为0.868～0.980，符合指纹图谱要求。

2. 5 花青素含量测定结果

如图3所示，经测定后发现，12个产地的巨峰葡萄中花青素含量整体较低，平均为1.51 mg/g，其中山东产地的含量最高（3.93 mg/g），最低的是湖北产地，含量仅为0.13 mg/g;12个产地的巨峰葡萄中花青素含量排序为山东>内蒙古>四川>江西>广东>新疆>福建>贵州>北京>浙江>重庆>湖北，各产地的含量间均存在显著差异（P<0.05，下同）。

2. 6 抗氧化活性能力测试结果

如图4和图5所示，12个产地富含花青素的巨峰葡萄提取物（浓度均为1 mg/mL）对DPPH和ABTS自由基的清除率趋势基本相同。对DPPH自由基的清除能力，以福建产地的巨峰葡萄提取物最强，清除率为60.69%，显著高于其他产地，贵州、内蒙古、新疆和四川4个产地的清除率均在30.00%以上，其中内蒙古、新疆和四川产地间的DPPH自由基清除率无显著差异（P>0.05，下同），浙江、广东、山东、重庆、北京、湖北和江西7个产地的清除率在20.00%～30.00%，山东、重庆、北京和湖北产地间的DPPH自由基清除率无显著差异;对ABTS自由基的清除能力，同样以福建产地的巨峰葡萄提取物最强，清除率为57.67%，也显著高于其他产地，四川与浙江产地、广东与山东产地、北京与湖北及江西产地间的ABTS自由基清除率无显著差异。

2. 7 AChE抑制活性测试结果

如图6所示，12个产地富含花青素的巨峰葡萄提取物（浓度5 mg/mL）对AChE的抑制率以山东产地的最高（33.6%），其次是福建（28.8%），两个产地的AChE抑制率显著高于其他10个产地，其他10个产地巨峰葡萄提取物对AChE的抑制率在10.0%～20.0%内浮动;除浙江与湖北产地间的AChE抑制率无显著差异外，其余产地间均存在显著差异。

2. 8 α-淀粉酶抑制活性测试结果

由图7可知，富含花青素巨峰葡萄提取物对α-淀粉酶的抑制率相对较高，在相同浓度下以浙江产地巨峰葡萄的抑制率最高（由于保证各产地样品浓度相同，浙江产地的巨峰葡萄花青素提取物对α-淀粉酶完全抑制），内蒙古、北京、四川和山东产地的抑制率均低于50.0%，分别为27.8%、32.0%、46.2%和46.7%，其余产地的抑制率排序为新疆>福建>广东>贵州>重庆>湖北>江西，其中福建与广东产地、四川与山东产地间的α-淀粉酶抑制能力无显著差异。

2. 9 谱—效关系分析结果

2. 9. 1 Pearson相关分析 由表4可知，ABTS自由基清除率与DPPH自由基清除率呈极显著正相关（P<0.01，下同），相关系数为0.994，说明两种方法评价抗氧化能力结果一致，且抗氧化能力与12、21、50号峰均呈显著或极显著正相关，但与9和55号峰的相关性不显著，可能由于12、21和50号峰是影响巨峰葡萄提取物抗氧化能力的主要因素。α-淀粉酶抑制活性与花青素含量呈显著正相关，相关系数为0.599，说明巨峰葡萄提取物对α-淀粉酶抑制活性起主要作用的是花青素。12、21和50号峰与AChE抑制活性的相關系数均大于0.500，表明这3种物质对AChE活性具有一定的抑制作用。

2. 9. 2 灰色关联度分析 由表5可知，DPPH自由基清除率与巨峰葡萄提取物的5个共有特征峰的关联顺序为X4>X2>X5>X1>X3，ABTS自由基清除率与5个共有特征峰的关联顺序为X2>X4>X5>X3>X1，花青素含量与5个共有特征峰的关联顺序为X4>X5>X2>X3=X1，α-淀粉酶抑制活性与5个共有特征峰的关联顺序为X5>X1>X4>X2>X3，AChE抑制活性与5个共有特征峰的关联顺序为X4>X5>X2>X3>X1。所测4种生物活性和花青素含量与各共有峰的关联系数在0.5963～0.7371，处于中等关联度范围，其中DPPH和ABTS自由基清除率与共有峰的关联顺序基本一致，与相关性分析结果吻合，对抗氧化活性影响最大的为12和50号峰，同时50号峰是影响花青素含量和AChE抑制活性的主要色谱峰，55号峰对α-淀粉酶抑制活性的关联性最强。

2. 9. 3 偏最小二乘法 将样品特征图谱的共有峰峰面积分别与DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、花青素含量、α-淀粉酶抑制活性和AChE抑制活性各指标结果录入SIMCA 14.1进行分析，获得回归方程系数图和回归线性图（图8）。由图8可知，巨峰葡萄提取物的5个共有峰与DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、AChE抑制活性有一定线性关系，与花青素含量和α-淀粉酶抑制活性无线性关系。除9号峰外，12、21、50和55号峰与DPPH、ABTS自由基清除率的回归系数均为正值，且50号峰最大，55、21和12号峰次之。12、21和50号峰对花青素含量有贡献，9和55号峰对其回归系数为负数;9、21和55号峰对α-淀粉酶抑制活性有一定贡献，12和50号峰对其回归系数为负值;12、21和50号峰对AChE抑制活性有较大贡献，9和55号峰对AChE抑制活性回归系数为负值，与Pearson相关分析结果一致。

3 讨论

花青素因具有抗氧化、改善血液循环、抗炎症、抗过敏、抗肿瘤等多种生物活性而备受相关食品行业及医药领域的重视。本研究采用微波提取法对12个不同产地的巨峰葡萄进行花青素提取，并测定其含量，结果发现不同产地样品中的花青素含量存在显著差异，究其原因可能与样品的生长环境、采摘季节等因素有关。对不同产地巨峰葡萄样品的抗氧化活性进行评价，发现巨峰葡萄表现出较强抗氧化活性，且呈较稳定趋势，个别产地的样品出现极低或极高的自由基清除率，说明同种样品仍会因为生长环境的差异导致其活性不同，但相对稳定，与高璐等（2014）、葛艳琳（2018）研究发现葡萄花青素具有抗氧化活性的结论一致。此外，刘学铭等（2014）、张玲艳和王宏权（2014）、陈月英等（2016）、冯贵涛（2016）分别对桑葚、荔枝壳、紫心红薯、葡萄籽、黑枸杞、葡萄皮渣和蓝莓进行花青素抗氧化活性评价，证实来自不同植物资源的花青素均具有抗氧化活性。

本研究采用改良的Ellman法测定12个产地富含花青素巨峰葡萄提取物的AChE抑制活性，结果表明，不同产地巨峰葡萄的AChE抑制活性存在明显差异，以山东产地巨峰葡萄提取物对AChE活性的抑制效果最佳。花青素通过对AChE活性的抑制可阻断神经元间传导质乙酰胆碱的分解，有效预防和缓解阿尔茨海默病（谢荣源，2014），但具体入药效果还需进一步体内研究证明。本研究还发现巨峰葡萄花青素提取物对α-淀粉酶活性具有良好的抑制作用，与杨雪娜（2016）、郭雅靖等（2017）研究发现葡萄籽、高粱麸皮、冷撒果皮及龙眼皮花青素具有良好α-淀粉酶抑制活性的结论一致，但本研究的内容与形式相对更具针对性和全面性。α-淀粉酶是调节血糖的关键酶，其抑制剂可特异性抑制α-淀粉酶水解，通过影响葡萄糖的吸收和释放来调节餐后血糖，临床医学可用于防治糖尿病、高血糖、高血脂、肥胖症等疾病，葡萄花青素作为天然的α-淀粉酶抑制剂具有良好前景。

本研究通过Pearson相关、灰色关联度和偏最小二乘3种分析方法对样品的各指标进行谱—效关系探究，结果表明，DPPH和ABTS两种方法均可用于评价巨峰葡萄提取物的抗氧化活性能力。在巨峰葡萄提取物特征图谱的5个共有特征峰中，21和50号峰对其抗氧化活性起主要作用;50号峰与花青素含量相关性较强;9、21和55号峰对α-淀粉酶抑制活性具有一定贡献;12、21和50号峰与AChE抑制活性相关性强，具有较大贡献。

本研究选取12个不同产地的巨峰葡萄为研究对象，较传统分析方法的研究内容与形式更严谨，研究结果也更具可比性、系统性和科学性，对AChE抑制活性和α-淀粉酶抑制活性及各指标间的谱—效关系的研究为葡萄花青素生物活性的深入研究提供了可靠参考依据和新思路。但花青素在人体内的药用效果还需进一步验证，花青素结构与各生物活性间的深入关系及相关机理机制是今后研究的重点方向。

4 结论

12个不同产地富含花青素的巨峰葡萄均具有良好的抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性及AChE抑制活性，可作为抗氧化、预防治疗高血糖和阿尔茨海默病的潜在物质，有良好的功能食品开发前景;对各试验指标进行谱—效关系分析，找到各成分对生物活性药效的贡献率，为富含花青素植物资源的相关活性与谱—效关系研究提供了新的研究模式和方向。

参考文献：

陈华国，周洁，周欣. 2018. 响应面法优化红布林中花青素提取工艺研究[J]. 贵州师范大学学报（自然科学版），36（3）：23-28. [Chen H G，Zhou J，Zhou X. 2018. Optimization extraction of anthocyanin from red plum by response surface methodology[J]. Journal of Guizhou Normal University（Natural Sciences），36（3）：23-28.]

陈月英，王彦平，孙瑞琳，杨会会，谢克英，古洋. 2016. 葡萄皮渣原花青素酶法提取工艺优化及抗氧化性研究[J]. 北方园艺，（16）：129-132. [Chen Y Y，Wang Y P，Sun R L，Yang H H，Xie K Y，Gu Y. 2016. Study on optimization of enzyme-assisted extraction of proanthocyanidins from grape residues and its antioxidant activity[J]. Northern Horticulture，（16）：129-132.]

杜月娇，贺阳，文连奎. 2017. 山葡萄花青素超高压提取工艺优化及其组分分析[J]. 食品科学，38（10）：258-263. [Du Y J，He Y，Wen L K. 2017. Optimization of ultra-high pressure extraction of anthocyanins from Vitis amurensis Rupr. and analysis of its anthocyanin composition[J]. Food Science，38（10）：258-263.]

冯贵涛. 2016. 蓝莓花青素提取、纯化、成分鉴定及抗氧化活性的研究[D]. 贵阳：贵州大学. [Feng G T. 2016. Extraction，purification，component identification and antioxidant of blueberry anthocyanins[D]. Guiyang：Guizhou University.]

高璐，王滢，饶胜其，杨振泉，黄阿根，胡博然. 2014. 葡萄籽原花青素提取物对衰老模型小鼠抗氧化作用[J]. 食品科学，35（23）：253-256. [Gao L，Wang Y，Rao S Q，Yang Z Q，Huang A G，Hu B R. 2014. Antioxidant activity of grape seed proanthocyanidin extract in aging mouse mo-del[J]. Food Science，35（23）：253-256.]

葛艷琳. 2018. 山葡萄皮花青素超声波辅助提取及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，39（10）：48-55. [Ge Y L. 2018. Ultrasonic assisted extraction technology and its antioxidant activity of Vitis amurensis Rupr skin antho-cyanin[J]. Food Research and Development，39（10）：48-55.]

郭雅靖，颜梦婷，林圣楠，杨雪娜，付才力，黄德建. 2017. 几种原花青素的降血糖作用及与常见食品原料的结合研究[J]. 食品科学，38（19）：156-163. [Guo Y J，Yan M T，Lin S N，Yang X N，Fu C L，Huang D J. 2017. Binding interaction of selected proanthocyanidins possessing hypoglycemic activity with common food raw materials[J]. Food Science，38（19）：156-163.]

刘学铭，黄小霞，廖森泰，杨荣玲，陈智毅，邹宇晓. 2014. 3种富含花青素植物提取物抗氧化和降血脂活性比较研究[J]. 中国食品学报，14（1）：20-27. [Liu X M，Huang X X，Liao S T，Yang R L，Chen Z Y，Zou Y X. 2014. Antioxidant activities and hypolipidemic effects of three di-fferent anthocyanin-enriched extracts[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，14（1）：20-27.]

孙建霞，张燕，胡小松，吴继红，廖小军. 2008. 花青素的提取、分离以及纯化方法研究进展[J]. 食品与发酵工业，34（8）：111-117. [Sun J X，Zhang Y， Hu X S，Wu J H，Liao X J. 2008. Review on the methods of extraction，isolation and purification of anthocyanins[J]. Food and Fermentation Industries，34（8）：111-117.]

謝荣源. 2014. 阿尔茨海默病药物治疗的研究进展[J]. 常州大学学报（自然科学版），26（3）：56-63. [Xie R Y. 2014. Recent research progress on medical treatment for alzheimers disease[J]. Journal of Changzhou University（Natural Science Edition），26（3）：56-63.]

徐春明，庞高阳，李婷. 2013. 花青素的生理活性研究进展[J]. 中国食品添加剂，（3）：205-210. [Xu C M，Pang G Y，Li T. 2013. Progress in the research on physiological activities of anthocyanin[J]. China Food Additives，（3）：205-210.]

杨慧，贾文婷，吴宏，吴洪斌，金新文. 2015. 超声波辅助乙醇法浸提无核紫葡萄花青素工艺研究[J]. 中国酿造，34（5）：106-109. [Yang H，Jia W T，Wu H，Wu H B，Jin X W. 2015. Ultrasound-assisted ethanol extraction technology of anthocyanin from monukka grapes[J]. China Bre-wing，34（5）：106-109.]

杨雪娜. 2016. 不同来源原花青素的α-淀粉酶抑制活性及应用研究[D]. 福州：福州大学. [Yang X N. 2016. Sudies on the α-amylase inhibition activities and applications of proanthocyanidins from plants[D]. Fuzhou：Fuzhou University.]

张玲艳，王宏权. 2014. 黑枸杞花青素的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工业，35（12）：88-91. [Zhang L Y，Wang H Q. 2014. Extraction of anthocyanin from Lycium ruthenicum Murr and its antioxidation[J]. Food Industry，35（12）：88-91.]

Cassidy A，Mukamal K J，Liu L，Franz M，Eliassen A H，Rimm E B. 2013. A high anthocyanin intake is associa-ted with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women[J]. Circulation，127（2）：188-196.

Ellman G L，Courtney K D，Jr A V，Featherstone R M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J]. Biochemical Pharmacology，7（2）：88-95.

Frenich A G，Aguilera-Luiz M M，Vidal J L M，Romero-González R. 2010. Comparison of several extraction techniques for multiclass analysis of veterinary drugs in eggs using ultra-high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，661（2）：150-160.

Kharadze M，Japaridze I，Kalandia A，Vanidze M. 2018. Anthocyanins and antioxidant activity of red wines made from endemic grape varieties[J]. Annals of Agrarian Scien-ces，16（2）：181-184.

Kim D O，Jeong S W，Lee C Y. 2003. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums[J]. Food Chemistry，81：321-326.

Marcia D S P，Kwon Y I，Apostolidis E，Lajolo F M，Genovese M I，Shetty K. 2009. Potential of Ginkgo biloba L. leaves in the management of hyperglycemia and hypertension using in vitro models[J]. Bioresource Technology，100（24）：6599-6609.

MohdMaidin N，Oruna-Concha M J，Jauregi P. 2018. Surfactant TWEEN20 provides stabilisation effect on anthocyanins extracted from red grape pomace[J]. Food Chemistry，271：224-231.

Wen Y，Chen H G，Zhou X，Deng Q F，Zhao Y，Zhao C，Gong X J. 2015. Optimization of the microwave-assisted extraction and antioxidant activities of anthocyanins from blackberry using a response surface methodology[J]. Rsc Advances. doi：10.1039/c4ra16396f.

Wen Y，Chen H G，Zhou X，Deng Q F，Zhao Y，Zhao C，Gong X J. 2016. A polyamide resin based method for adsorption of anthocyanins from blackberries[J]. New Journal of Chemistry，40（4）：3773-3780.