露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系的建立

王羽晗 李子豪 李世彪 陈驰航 王瑜麟 吴雅妮 张旸

摘要：【目的】建立露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系，为菊花品质改良提供参考依据。【方法】采用农杆菌真空渗透和浸染转化法对露地菊火焰的脚芽进行目的基因遗传转化，分析其PCR结果，以抗性分化苗叶片进行β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）组织染色验证转基因植株，分析农杆菌真空渗透转化率。【结果】将含AtLFY基因和AtCO基因的表达载体分别转入露地菊根部脚芽中，通过PCR检测GUS染色鉴定后，真空渗透1次的平均转化率为11.97%，真空渗透2次的平均转化率为15.86%，菌液浸染10 min的平均转化率为3.64%，菌液浸染20 min的平均转化率为11.14%，总体嵌合率为14.58%。【结论】建立的露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系对露地菊的遗传转化效率高，可操作性强。

关键词： 露地菊;农杆菌;真空渗透转化技术;浸染;脚芽;遗传转化

中图分类号： S682.1                              文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2236-06

Establishment of vacuum infiltration and transformation technique of Agrobacterium in Chrysanthemum morifolium

foot buds

WANG Yu-han， LI Zi-hao， LI Shi-biao， CHEN Chi-hang， WANG Yu-lin，

WU Ya-ni， ZHANG Yang*

（College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin  150040， China）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to establish a vacuum infiltration transformation technology system of Agrobacterium in Chrysanthemum morifolium foot buds in open field and provide reference for improving the quality of Chrysanthemum. 【Method】Target genes of C. morifolium Flame foot buds were genetically transformed by Agrobacterium infiltration and transformation，and the results of PCR were analyzed. Gus-stained leaves of resistance differen-tiation seedlings were used to verify transgenic plants， and Agrobacterium transformation rate under vacuum infiltration was studied. 【Result】The expression vectors containing AtLFY and AtCO genes were respectively transferred into the foot buds of C. morifolium. After being identified by PCR and β-glucuronidase（GUS） staining， the transformation rate of va-cuum infiltration for once was 11.97% on average，transformation rate of vacuum infiltration for twice was 15.86% on avera-ge. The average transformation rate was 3.64% after 10 min of dipping in bacteria liquid，the average transformation rate was 11.14% after dipping in bacteria liquid for 20 min，and the overall chimerism rate was 14.58%. 【Conclusion】Therefore，the established Agrobacterium vacuum infiltration and transformation method for C. morifolium is with high genetic transformation efficiency and strong operability.

Key words： Chrysanthemum morifolium; Agrobacterium; vacuum infiltration and transformation; dipping; foot shoot; genetic transformation

0 引言

【研究意義】露地菊（Chrysanthemum morifolium）是菊科菊属多年生草本植物，其株型矮壮，具有抗寒、抗旱、抗瘠薄、抗病虫、开花繁盛和管理粗放等特点，在园林绿化和观光园区布景中占有重要地位。为了提高露地菊的观赏品质，通常采用转基因方法对其花色、花期、花型和抗性等进行改良。菊花的遗传转化多以叶片、花梗、茎段为外植体材料进行农杆菌浸染，也有研究尝试使用花瓣、子房、叶柄、叶轴、愈伤组织和原生质体等作为农杆菌浸染的外植体（李辛雷等，2004;毛洪玉等，2005;任永霞等，2005;于利刚等，2011;张志玲等，2011）。目前对菊花进行遗传转化通常采用农杆菌介导叶盘转化法，存在操作复杂、转化周期长及转化率低等缺点（佟玲，2012），且需进行大量的组织培养试验才能得到完整的转基因植株。因此，建立露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系，对改良菊花品质具有重要意义。【前人研究进展】Tosca等（2000）、Shinoyama等（2002）、蒋细旺和包满珠（2003）利用玉米AC/DS转座系统研究菊花转化效率，结果发现AC/DS周围基因标签系统成功插在活性位点上，转化频率达7.8%，远高于一般研究的转化频率（3.0%～5.2%）。刘军等（2004）研究表明，用无菌滤纸浸蘸MS培养基覆盖在接种菊花叶盘上，可提高其叶盘转化率。张燕红等（2008）利用农杆菌真空渗透转化法转化棉花花粉，发现当真空渗透转化时间维持15～25 min时，可降低花粉的破损率和提高瞬时转化效率。陈天子（2009）研究认为，通过农杆菌浸蘸棉花花柱进行整株活体转化可提高棉花遗传转化率。唐宜等（2017）以非洲菊舌状花花瓣为材料，利用农杆菌真空渗透法成功建立了花瓣瞬时表达系统。【本研究切入点】真空渗透法和浸染法是非组培法，但目前利用真空渗透法和浸染法进行菊花脚芽转基因操作的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选用露地菊品种火焰的脚芽为受体，通过真空渗透和浸染法将构建的pCAMBIA1301-AtCO和pCAMBIA1301-AtLFY质粒载体分别转入其中，诱导其开花和维持花的正常发育，建立露地菊脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系，为菊花品质改良提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

选取已成熟露地菊品种火焰种子种植于东北林业大学花卉工程研究所苗圃。从苗圃地中选择其成熟植株，从土壤中挖出根部脚芽，摘取其长约3.0 cm的脚芽用于后续试验。pCAMBIA1301-PMI载体中包含一个磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase，PMI）筛选基因和GUS报告基因。目的基因AtLFY（ID：836307）和AtCO（ID：831441）均从拟南芥中克隆获得，其质粒物理图谱见图1和图2。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 农杆菌真空渗透和浸染法转化露地菊脚芽

采用真空渗透和浸染法对露地菊脚芽目的基因进行遗传转化（农杆菌浓度OD800为0.4～0.6）。

农杆菌真空渗透法（仪器为Heto DRYWINNER）：将摘取的400棵脚芽随机分为4份，每份100棵，分别用含AtLFY和AtCO目的基因农杆菌的LB液体培养基对脚芽进行真空渗透（以150 mL LB液體培养基浸泡100棵脚芽）。设真空渗透1次（约3 min）和真空渗透2次（约7 min）两个试验梯度。以菌液真空渗透沸腾1次为计量标准处理100棵脚芽。真空处理后再恢复常压，使农杆菌菌液渗入植物组织内部。每次处理100棵脚芽，每个梯度2个处理和2个目的基因，总计400棵脚芽。

农杆菌浸染法：与真空渗透法一样，将400棵脚芽随机分为4份，每份100棵，分别用含AtLFY/AtCO目的基因农杆菌的LB液体培养基处理试验脚芽（以150 mL LB液体培养基浸染100棵脚芽）。设菌液浸蘸10 min和菌液浸蘸20 min两个试验梯度。每次处理100棵脚芽，每个梯度2个处理和2个目的基因，总计400棵脚芽。

1. 2. 2 转化后脚芽扦插 将转化后的脚芽扦插于沙盆中暗培养1 d，之后按光照/黑暗培养16 h/8 h。待脚芽长至5～6叶进行后续试验。

1. 2. 3 转基因植株筛选

1. 2. 3. 1 总DNA提取（CTAB法） 提取步骤：①向1.5 mL EP管中加入700.0 μL 2% CTAB抽提液、15.0 μL β-巯基乙醇，少许PVP;②选取3～4片露地菊的新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末后立即转入1.5 mL加有抽提液的离心管中，轻缓摇动混匀;③加入等体积的苯酚/氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀，将离心管放入冷冻离心机，4 ℃下12000 r/min离心10 min;④取上清液置于一个新的离心管中，重复进行③的操作;⑤再取上清液置于一个新的离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇，混匀，将离心管放入冷冻离心机，4 ℃下12000 r/min离心10 min;⑥小心取上清液，加入等体积的异丙醇（提前预冷），混匀，出现白色絮状物即为成功提取DNA，冰上静置30 min;⑦将离心管放入冷冻离心机，4 ℃下12000 r/min离心10 min，弃上清液，加入800.0 μL 75%乙醇清洗沉淀;⑧将离心管放入冷冻离心机，4 ℃，12000 r/min离心10 min，弃上清液，室温干燥沉淀，加入20.0 μL灭菌去离子水溶解沉淀;⑨取1.5 μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，将剩余的DNA产物于4 ℃冰箱短期保存，-40 ℃冰箱长期保存。

1. 2. 3. 2 PCR检测 以经PMI基因筛选获得的露地菊火焰转化植株总DNA为模板，以pCAMBIA1301-PMI质粒DNA为阳性对照，野生型露地菊火焰为阴性对照，用生物安全性筛选标记基因PMI的1对特异性引物进行PCR扩增。

设计引物序列PMI-F：5'-GGGCATCGAGATGC

AAAAACTCATTAACT-3'，PMI-R：5'-ATACTCGAG

CAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA-3'，目的片段约1180 bp。PCR反应体系（20.0 μL）：DAN（50 ng/μL）模版1.0 μL，PMI-F和PMI-R（10 μL）各0.4 μL，Ex Taq DNA（5 U/μL）聚合酶10.0 μL，ddH2O 8.2 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环;72 ℃延伸7 min;10 ℃保存备用。

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后检测目标条带是否出现，并验证目的基因的遗传转化是否转化成功。

1. 2. 3. 3 GUS组织染色检测 采用GUS染色法进一步验证转基因植株。取筛选出的抗性分化苗叶片浸泡在GUS染色液中，于37 ℃保温过夜;将过夜染色后的叶片转入75%乙醇中脱色，直至叶片本身的色素去除干净;具有GUS活性的部位或位点呈蓝色或蓝色斑点，肉眼或显微镜下观察可见。

1. 2. 4 转基因植株表型鉴定 将筛选出的转基因植株移栽到小盆中，与野生型露地菊火焰植株进行表型比较，观测现蕾时间。

2 结果与分析

2. 1 真空渗透和浸染法转化露地菊的PCR检测结果

露地菊火焰脚芽经两种非组培法遗传转化处理后进行扦插繁殖，45 d后取新鲜叶片进行初步PCR检测。从图3可看出，1～6泳道均出现清晰的目的条带，从图4可看出，2、3、5、9、10、11、12、14、16和20泳道均出现清晰的目的条带，说明已成功克隆出目的基因。

对上述转入AtCO和AtLFY基因植株的PCR扩增结果进行归纳分析后，统计真空渗透1次和2次及菌液浸染10和20 min的目的基因转化率。由表1和表2可知，真空渗透和浸染法均能获得露地菊转基因植株，其中真空渗透1次的平均转化率为11.97%，真空渗透2次的平均转化率为15.86%，菌液浸染10 min的平均转化率为3.64%，菌液浸染20 min的平均转化率为11.14%。说明真空渗透法的平均转化率和菌液浸染法的平均转化率均优于常规转化方法（2.00%～6.00%）。

2. 2 转基因植株的GUS染色结果

为了进一步验证露地菊火焰转基因植株的真假，在其成花过程的现蕾期剪取花蕾附近的幼嫩叶片进行GUS染色（图5），发现58棵转基因植株中有10株自然死亡，20株染色（蓝色）明显，21株仅叶尖和叶片边缘染色，7株未染色，嵌合率为14.58%。说明真空渗透和菌液浸染法获得的转基因植株存在假阳性植株。

2. 3 转基因植株的表型观察

通过PCR鉴定和GUS染色等分子生物学鉴定，将从转化植株中筛选出的转基因植株与野生型露地菊火焰同时移至小盆中种植，自然光周期培养，进行表型观察，比较转基因植株与野生型植株花期（以整个株系显露50%花蕾为标准）的差异。从图6可看出，野生型植株未现蕾，而转基因植株提前1个月现蕾，说明露地菊的转基因效果明显，且可通过表型观察出来。

3 讨论

假阳性转化体的产生可能是PCR过程所引起。吴建祥等（2001）研究发现，以木糖和甘露糖对植物细胞进行毒害作用能有效降低假阳性芽产生，通过木糖和甘露糖对转基因植株进行筛选后可降低假阳性芽产生的概率。本研究中，在露地菊火焰目的基因转化植株繁殖至现蕾期时对其花蕾附近的叶片进行GUS染色验证，结果发现58棵转基因植株中有7棵植株未染出蓝色，表明在目的基因转化植株中已出现了假阳性植株或嵌合体。因此认为，木糖和甘露糖更适合作为菊花转基因筛选剂。

雷建峰等（2016）的研究结果表明，农杆菌真空转化与不抽真空转化棉花花粉的转化效率存在差异，且以真空转化的转化率明显高于不抽真空的转化率。本研究结果与其相似，露地菊脚芽的真空转化率高，可获得较多的转化植株，但因再生植株无性系变异明显，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多，导致试验中两种非组培转化法转化露地菊的转化率不稳定。

冯连荣等（2015）研究证实，农杆菌在培养基及材料表面过度增殖时，外植体会受到毒害，农杆菌的转化效率也受到影响。由于露地菊火焰脚芽及受伤的细胞容易受到病毒或质粒感染，这些病毒或质粒上的某些DNA通过不同方式转移到受伤的植物细胞并形成愈伤组织，因此，愈伤组织可培养成完整的转化植株，正常的转化效率会受到影响。

本研究结果表明，农杆菌真空渗透法对露地菊的转化率优于浸染法，二者均优于传统农杆菌介导转化法（转化效率一般为2.00%～6.00%）的转化效率。

4 结论

本研究成功建立了露地菊火焰脚芽农杆菌真空渗透转化技术体系，对露地菊的遗传转化效率高，可操作性强，可供菊花品质改良参考。

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