外源赤霉素对太子参块根中细胞分裂素含量及其代谢关键酶基因表达的影响

张晨 周涛 郑伟 李军 肖承鸿 龚安慧 江维克

摘要：【目的】分析外源赤霉素（GA3）對太子参块根中细胞分裂素（CTK）含量变化及其代谢关键酶基因表达的影响，为研究太子参块根膨大发育机制提供理论基础。【方法】将盆栽的太子参幼苗分成4组，其中3个处理组分别根灌150 mg/L GA3（GA3处理组）、20 mg/L多效唑（PBZ）（PBZ处理组）和150 mg/L GA3+20 mg/L PBZ（GA3+PBZ处理组）激素溶液各200 mL，对照组根灌等量清水，在不同块根发育期采集块根样品。运用酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同处理时间太子参块根中内源玉米素核苷（ZR）的含量，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析CTK代谢关键酶基因的表达量变化。【结果】在整个块根发育期，3个处理组太子参块根中的ZR含量总体高于对照组，且呈相同的变化趋势，即从膨大初期到成熟期ZR含量均呈升高—降低—升高的变化趋势，说明外源GA3和PBZ均能促进ZR含量的升高。在GA3处理组中，A-IPT1基因的表达量在膨大初期较对照组高，随着块根的膨大，其表达量呈先升高后降低的变化趋势，直至成熟期低于对照组;tRNA-DMATase基因的表达量在膨大初期较对照组低，随后不断上升高于对照组，呈先升高后降低的变化趋势; A-IPT2基因的表达量在整个太子参块根发育期略高于对照组，而CYP735A、CKX1和CKX2基因表达量均低于对照组。在PBZ处理组中，A-IPT1、tRNA-DMATase和CKX2基因的表达量变化趋势与GA3处理组相反。GA3+PBZ处理组A-IPT2、CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达量均明显高于其他组，且与对照组的变化趋势相似。外源GA3可上调A-IPT1和tRNA-DMATase基因的表达水平，下调CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达水平，结合ZR含量测定结果可推测CTK在块根膨大初期合成反式玉米素（tZ），而在成熟期合成顺式玉米素（cZ）。【结论】GA3调控CTK的合成和分解是一个动态过程，GA3抑制太子参块根膨大，可能与不同发育时期CTK的代谢有关。

关键词： 太子参;赤霉素（GA3）;细胞分裂素（CTK）;玉米素核苷（ZR）;代谢关键酶基因;克隆;表达分析

中图分类号： S567.530.353                         文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2141-07

Effects of exogenous gibberellin on cytokinin content variation in Pseudostellaria heterophylla root and metabolism key enzyme gene expression

ZHANG Chen， ZHOU Tao*， ZHENG Wei， LI Jun， XIAO Cheng-hong，

GONG An-hui， JIANG Wei-ke

（Guiyang University of Chinese Medicine， Guiyang  550002， China）

Abstract：【Objective】Effects of exogenous gibberellin（GA3） on cytokinin（CTK） content variation in Pseudostella-ria heterophylla  root and metabolism key enzyme gene expression were investigated to provide theoretical basis for studying the root enlargement mechanism of P. heterophylla. 【Method】The potted seedlings of P. heterophylla were divided into four groups. Three of the treatment groups were irrigated with 200 mL each of 150 mg/L GA3（GA3 treatment group）， 20 mg/L paclobutrazol（PBZ）（PBZ treatment group） and 150 mg/L GA3+20 mg/L PBZ（GA3+PBZ treatment group）. The control group was irrigated with equal amount of clear water. Root tuber samples were collected at different root development stages. The contents of endogenous zeatin riboside（ZR） in the roots of P. heterophylla during different treatment times were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELASA），the expression changes of  CTK metabolism key enzyme gene were determined by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】The results showed that the contents of ZR in root tuber of P. heterophylla treated with three treatments was higher than that of control group during the whole root tuber development period，and they all showed the same trend. The change of ZR content showed a rising-falling-rising trend from the early stage of enlargement to the mature stage，which indicated that both exogenous GA3 and PBZ could promote the increase of ZR content. The expression of A-IPT1 gene was up-regulated at the beginning of the enlargement by GA3 compared with control group. With the enlargement of roots，the expression rose first and then decreased，and then it was lower than that of the control group at mature period. The expression level of tRNA-DMATase gene was down-regulated at the beginning of enlargement compared with control and then continuously increased and was higher than the control group，which showed a trend of increasing first and then decreasing. The expression level of A-IPT2 gene was higher than control during the whole enlargement period of roots，while the expression levels of CYP735A，CKX1 and CKX2 were down-regulated compared with control group during the whole enlargement period of roots. In PBZ treatment group， the expression variation of A-IPT1，tRNA-DMATase and CKX2 genes were the opposite of those in GA3 treatment group. In GA3+PBZ treatment group， the expression of all genes were greatly higher than other groups， and the variation was consistent with that of the control group. Exogenous GA3 could up-regulate the expression levels of A-IPT1 and tRNA-DMATase genes，and down-regulate the expression levels of CYP735A，CKX1 and CKX2 genes. Combining the detection of ZR content， it was inferred that CTK synthesized trans-zeatin（tZ） at the early stage of root enlargement， and synthesized cis-zeatin（cZ） at the mature stage. 【Conclusion】The regulation effect of GA3 on CTK synthesis and decomposition is a dynamic process. GA3 can inhibit the enlargement of P. heterophylla root，which may be related to the metabolism of CTK at different developmental stages.

Key words： Pseudostellaria heterophylla;gibberellin（GA3）;cytokinin（CTK）; zeatin riboside（ZR）; metabolism key enzyme gene; clone; expression analysis

0 引言

【研究意义】太子参块根作为药材具有益气健脾、生津润肺功效，且富含多糖和氨基酸，亦可作为保健食物。目前，太子参主要以栽培为主，其产量和质量与块根的生长发育密切相关（康传志等，2014）。参与块根形成的内源激素主要有赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和细胞分裂素（CTK）等，其中GA3是块根形成和膨大的关键因子之一，可直接调控块根组织细胞分化，也可通过影响CTK等激素的生物代谢来调控块根的形成和膨大。因此，研究GA3对CTK代谢的影响对阐明内源激素调控块根膨大机制具有重要意义。【前人研究进展】前人研究表明，SPINDLY（SPY）既是GA3信号传导中的一个负向调控因子，又是CTK信号转导的正向调控剂（Greenboim-Wainberg et al.，2005）。GA3对CTK的合成具有抑制作用，如在水稻根分生组织形成过程中GA3含量降低，CTK含量升高（Sakamoto et al.，2006）;在地黄块根膨大過程中，当GA3合成关键酶基因表达量下调时，CTK合成和响应相关基因表达量会显著上调（王鹏飞等，2014）。但外施GA3能显著提高胡萝卜苗期和膨大期肉质根内源玉米素核苷（ZR）的含量，并抑制肉质根发育（杨永岗等，2014）。由此可见，在植物生长发育过程中GA3可能对CTK具有正、负调控作用，且GA3和CTK的代谢途径间存在交叉现象。异戊稀基转移酶（IPT）是CTK生物代谢途径中的第一个关键限速酶，根据其氨基酸序列特征可分为两类：一种是催化生成反式玉米素（tZ）的腺苷—异戊烯基转移酶（A-IPT），其具有组织表达特异性，高度同源基因的组织表达模式不同（任雪芹等，2013）;另一种是催化生成顺式玉米素（cZ）的tRNA二甲基烯丙基转移酶（tRNA-DMATase），其催化生成的cZ在调控植物发育及防御病原体等方面发挥新型应激反应标记的潜在作用（Miyawaki et al.，2006;Sch?fer et al.，2015）。研究发现，拟南芥细胞分裂素羟化酶（CYP735A）可通过异烯酰腺苷核苷5'-单磷酸（iPRMP）依赖途径催化合成tZ，CYP735A属于细胞色素P450酶家族（Takei et al.，2004）。此外，细胞分裂素氧化/脱氢酶（CKX）是一种能不可逆降解CTK的黄素酶，对维持植物中CTK的平衡发挥关键作用，如调控油菜BnCKX基因表达是提高油菜产量和抗逆性的有效途径（Liu et al.，2018）。【本研究切入点】在太子参块根发育分子机理的前期研究中，本课题组已成功克隆获得太子参的赤霉素2-氧化酶基因（GA2ox）（丁铃等，2017）和CKX基因（PhCKX）（张晨等，2017），但外施GA3对太子参块根发育中内源CTK代谢的调控机制尚不清楚，且鲜见相关研究报道。【拟解决的关键问题】分别外施GA3及其合成抑制剂多效唑（PBZ）处理太子参种苗，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同处理下太子参块根中的ZR含量，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析经GA3处理后太子参块根中CTK代谢相关基因A-IPT、CYP735A、tRNA-DMATase和CKX的表达情况，以期探究GA3对太子参块根中CTK代谢的调控作用，为太子参块根膨大机理的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

供试的太子参品种为贵州施秉本地种，其幼苗移栽于贵州施秉太子参种质资源圃。GA3和PBZ购于北京索莱宝科技有限公司;ELISA检测试剂盒由中国农业大学王保民博士提供;RNAiso Plus试剂盒、DNase I试剂盒、M-MLV反转录酶、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（TIi RNaseH Plus）等购自宝生物工程（大连）有限公司。主要仪器设备：旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）、Synergy 2荧光吸收光酶标仪（Biotek）、5810R台式冷冻离心机（Eppendorf，德国艾本德公司）和Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System（ABI，美国）。

1. 2 样品处理及采集

2016年4月移栽生长良好的太子参幼苗于花盆（30 cm×30 cm）中，每盆6～7株，盆内土壤为混合土（普通土∶营养土∶珍珠岩∶蛭石=3∶3∶1∶1），自然条件下生长。待移栽幼苗长出幼叶时，随机选取20盆作为试验材料，分成3个处理组和1个对照组，其中3个处理组分别于傍晚时分根灌150 mg/L GA3（GA3处理组）、20 mg/L PBZ（PBZ处理组）和150 mg/L GA3+20 mg/L PBZ（GA3+ PBZ处理组）激素溶液各200 mL，对照组根灌等量清水。每隔10 d根灌1次，共浇灌5次。分别于膨大初期（第1次浇灌后20 d）、膨大中期（第1次根灌后40 d）、膨大后期（第1次根灌后50 d）、成熟期（第1次根灌后60 d）时采集太子参块根样品。液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 3 ZR提取及含量测定

分别取膨大初期、膨大中期、膨大后期和成熟期的太子参块根各0.5 g，分别加入内源激素提取液2 mL，在冰浴下研磨成匀浆后转入10 mL离心管，用2 mL内源激素提取液分多次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后置于4 ℃冰箱中静置4 h，10000 r/min离心10 min后收集上清液，在沉淀中加入内源激素提取液1 mL提取，再次离心，合并上清液，再采用C18型固相萃取柱进行萃取，收集样品，转入旋转蒸发器浓缩干燥，用样品稀释液溶解定容至2 mL。按照ELISA试剂盒说明进行ZR含量测定。

1. 4 总RNA提取及cDNA第一链合成

根据RNAiso Plus试剂盒说明提取太子参块根总RNA，并采用DNase I试剂盒进行纯化。以高纯度的RNA为模板、Oligo11T（50 μmol/L）为引物，利用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。

1. 5 基因筛选及其引物设计

从NCBI数据库中下载拟南芥、水稻等模式植物的CTK代谢关键酶基因序列，以其为查询序列（Query sequence）从太子参转录组数据库中进行同源搜索，经序列比对后共获得6个疑似为太子参CTK代谢关键酶基因序列，包括2个A-IPT基因家族成员（A-IPT1和A-IPT2）、2个CKX基因家族成员（CKX1和CKX2）、1个CYP735A基因及1个tRNA-DMATase基因，如表1所示。利用Primer Premier 5.0设计其特异性引物（表2）。运用GenScript Real-time PCR（TaqMan） Primer Design在线工具设计其qRT-PCR引物（表2），并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1. 6 转录组差异表达分析

根据本课题组前期测定的太子参转录组数据（Li et al.，2017）分析太子参块根（韧皮部和木质部）、花、茎和叶中CTK生物代谢关键酶基因A-IPT1、A-IPT2、CYP735A、tRNA-DMATase、CKX1和CKX2的表达水平。

1. 7 PCR扩增

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增A-IPT1、A-IPT2、CKX1、CKX2、CYP735A和tRNA-DMATase基因序列。PCR反应体系25.0 μL：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 Plus dye） 12.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（表2）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，灭菌ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s;98 ℃ 10 s，各退火温度（表2）退火30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 8 qRT-PCR检测

采用qRT-PCR检测不同激素处理组A-IPT1、A-IPT1CKX1、CKX2、CYP735A和tRNA-DMATase基因的相对表达量。反应体系20.0 μL：SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（表2）各0.8 μL，ROX Reference Dre Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，RNAase-free ddH2O补足至20.0 μL。以PhACTIN作为内参基因，各3次重复。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，进行40个循环。熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。

1. 9 数据分析

试验数据采用Excel 2007进行统计并作图。

2 结果与分析

2. 1 CTK代谢关键酶基因克隆结果

如图1所示，PCR产物长度分别为1443、500、1805、1554、1972和1945 bp，与预期结果相符。

2. 2 CTK生物合成关键酶基因的转录组差异表达分析结果

对太子参转录组的数据进行分析，结果如图2所示。A-IPT1基因均以在茎中的表达量最高，推测其可能对太子参茎的发育发挥调控作用。虽然CYP735A基因和CKX1基因在不同组织中表达量存在差异，但均在块根（韧皮部和木质部）中表达量最高，表明CYP735A和CKX1基因与太子参块根的生长发育密切相关。tRNA-DMATase基因在5个组织中均有较高的表达，无明显差异，以在叶和茎中的表达量较高，花次之，块根（韧皮部和木质部）中表达最低，说明tRNA-DMATase基因对太子参叶和茎的发育发挥调控作用。CKX2基因在5个组织中均有表达，尤其在花中的表达量明显高于其他组织，说明CKX2基因对花发育具有调控作用。由此推测，CTK生物代谢关键酶基因A-IPT1、CYP735A、tRNA-DMATase、CKX1和CKX2的表达水平与太子参器官组织的生长过程有关。

2. 3 GA3和PBZ处理对太子参块根中内源ZR含量的影响

由图3可知，对照组的ZR含量在块根膨大初期最低，随着块根的发育，其含量不断升高。在整个块根发育期，3个处理组的太子参块根中ZR含量整体高于对照组（除GA3+PBZ处理彭大后期外），且均呈相同的变化趋势，即在膨大中期快速升高，随着块根的发育逐渐降低，在成熟期又逐渐升高，说明外源GA3和PBZ均能促进ZR含量的增加。虽然GA3+PBZ处理组块根中ZR含量的变化趋势与GA3处理组和PBZ处理组相似，但在膨大后期ZR含量明显低于对照组，表明GA3和PBZ混合处理可引起激素的生理作用发生改变。综上所述，外源GA3能促进ZR含量的增加，且呈升高—降低—升高的变化趋势。

2. 4 CTK代谢关键酶基因表达分析结果

采用qRT-PCR检测膨大初期、膨大中期和成熟期太子参块根中CTK代谢关键酶基因表达情况，结果如图4所示。在对照组中，A-IPT1基因的表达量呈缓慢升高的趋势，而tRNA-DMATase基因的表达量呈逐渐降低的趋势，A-IPT2、CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达量均表现为先升高后降低的趋势。在GA3处理组中，A-IPT1基因在膨大初期表达量较对照组高，随着块根的发育呈先升高后降低的变化趋势，直至成熟期低于对照组;A-IPT2基因在整个块根发育期表达量略高于对照组;CYP735A、CKX1和CKX2基因表达量在太子参块根整个膨大期均低于对照组，表明GA3在CTK代谢中促进A-IPT1和A-IPT2基因表达，抑制CYP735A、CKX1和CKX2基因表达;tRNA-DMATase基因的表達量在膨大初期低于对照组，随后不断上升高于对照组，呈先升高后降低的变化趋势，但总体表达量上调。PBZ处理组中，A-IPT1和tRNA-DMATase基因的表达量变化趋势与GA3处理组相反;A-IPT2、CYP735A、CKX1和CKX2基因在整个根块发育期具有相似的表达模式，均呈先升高后降低的变化趋势。CKX2基因表达量在PBZ处理后上调。GA3+PBZ处理组中A-IPT2、CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达量均明显高于其他组，且与对照组的变化趋势相似。可见，A-IPT1、A-IPT2、CYP735A、tRNA-DMATase、CKX1和CKX2基因的表达均受GA3的调控，各基因表达变化可能导致内源ZR含量的变化，从而影响太子参块根的发育。

3 讨论

CTK是由多种组分组成的一类植物激素，植物体内天然的游离态CTK有ZR、玉米素（ZT）、二氢玉米素（DHZ）、二氢玉米素核苷（DHZR）、异戊烯基腺嘌呤（IP）等，其中高等植物中CTK的运输形式主要是ZT或ZR（王庆美等，2005;段娜等，2015）。本研究结果表明，在整个根块发育期，外施GA3后太子参块根中ZR含量呈升高—降低—升高的变化趋势，其中膨大中期ZR含量明显升高，说明使用150 mg/L GA3可促进内源ZR的合成。该结论同样在其他作物中有类似的报道，即外源GA3可促进雾培马铃薯（Qin and Wang，2006）、烤烟叶片（周继华等，2009）和高原夏季胡萝卜（杨永岗等，2014）等作物ZR含量的升高。由此推测，太子参块根膨大中期CTK是不定根转化形成块根的主要植物激素;膨大后期ZR含量下降可能是多种植物激素相互作用的结果。外施GA3后太子参块根成熟期ZR含量明显上升，且有效化学成分含量大幅度提高（张晨等，2018）;喷洒CTK可显著提高菊苣和紫花苜蓿的粗蛋白和粗纤维含量（刘大林等，2005;葛建东等，2009）。可见，CTK在太子参生长发育后期对其块根品质发挥重要的作用。

植物体内CTK的合成途径主要是从头合成途径，A-IPT和CYP735A是催化生成tZ的两类关键酶，而tRNA-DMATase主要催化生成cZ，CKX則是降解细胞内CTK的关键酶（Wang et al.，2014;Sch?fer et al.，2015）。本研究中，GA3对A-IPT1、A-IPT2和tRNA-DMATase基因表达水平产生明显影响，可导致GA3在膨大初期促进太子参块根中tZ的合成，但抑制cZ的合成，随着块根的膨大，tZ的合成逐渐降低，而在成熟期GA3抑制tZ的合成。结合本研究内源激素含量测定结果可推测太子参块根膨大初期合成的玉米素是tZ，而成熟期合成的是cZ;GA3抑制CKX1和CKX2基因表达可引起太子参块根中CTK的积累，进一步证实了李军等（2017）的研究结论，即GA3对太子参块根形成的负调控作用是通过促进CTK积累来实现。综上所述，GA3在太子参块根发育的不同时期对CTK含量影响不同，表明GA3调控CTK的合成和分解是一个动态过程，影响太子参块根产量。

在今后的研究中，可通过测定太子参块根中乙烯、生长素等激素含量及其代谢相关基因的表达量，分析外源GA3对各内源激素代谢的影响，进一步揭示GA3抑制太子参块根膨大的分子机制。

4 结论

GA3调控CTK的合成和分解是一个动态过程，GA3抑制太子参块根膨大，可能与不同发育时期CTK的代谢有关。

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