袋装临沧铁壳麦种子生活力及a-淀粉酶、脂肪氧化酶活性与表达量分析

周国雁 隆文杰 陈丹 武晓阳 伍少云 蔡青

摘要：【目的】研究鋁箔袋真空密封和尼龙网袋非密封方法包装贮藏的临沧铁壳麦种子生活力指标、贮藏期、a-淀粉酶和脂肪氧化酶（LOX）活性及其基因相对表达量间的关系，了解其a-淀粉酶和LOX活性及其基因相对表达量变化影响种子贮藏期的酶学机制，为更好地保存临沧铁壳麦等云南小麦亚种资源提供参考依据。【方法】将临沧铁壳麦种子真空密封于铝箔袋和非密封包装于尼龙网袋内，在昆明室内温、湿度条件下贮藏63、125、189、210、252和365 d。采用标准发芽试验、3，5-二硝基水杨酸、分光光度计和实时PCR（RT-PCR）方法，分别测量种子的生活力指标、a-淀粉酶和LOX活性及其基因相对表达量，并进行简单相关和逐步回归分析。【结果】真空密封包装的种子在贮藏125 d后，发芽势为78.3%，发芽率为96.7%，加权发芽指数为0.622，发芽指数为30.933，活力指数为539.1，而非密封包装的种子在贮藏125 d后发芽势、加权发芽指数及发芽指数已明显下降，至189 d时观测的5项生活力指标均出现断崖式下降，分别只有125 d时的14.9%～25.0%。两种方法包装贮藏后的种子，a-淀粉酶和LOX活性无明显差异。种子贮藏期与生活力指标、酶活性及其基因相对表达量的简单相关及逐步回归分析结果表明，在昆明室内温、湿度条件下，非密封方法包装贮藏的临沧铁壳麦种子贮藏期随加权发芽指数和LOX活性的增加而缩短，随a-淀粉酶活性和TaLOX3-4A基因相对表达量的增加而延长，但真空密封方法包装贮藏的种子，其贮藏期只随a-淀粉酶基因amy3相对表达量的减少而延长。【结论】真空密封在铝箔袋中的临沧铁壳麦种子具有更长的、保持高生活力的贮藏期，其贮藏期不随a-淀粉酶和LOX活性变化而发生变化。

关键词： 真空密封包装;临沧铁壳麦种子;a-淀粉酶;脂肪氧化酶（LOX）;基因相对表达量;生活力

中图分类号： S325.1;S512.1                             文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2273-09

Analysis of seed viability， a-amylase activity， lipoxygenase activity， and expression levels of Lincang hulled

wheat seed in bags

ZHOU Guo-yan， LONG Wen-jie， CHEN Dan， WU Xiao-yang，

WU Shao-yun*， CAI Qing*

（Biotechnology and Germplasm Resources Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology/Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming  650205， China）

Abstract：【Objective】Relationship between vacuum sealed package by aluminium foil bag and non-sealed package by nylon mesh bag in viability index，periods of seed stored（PSS）， activities of a-amylase and lipoxygenase（LOX）and gene relative expression of the Lincang hulled wheat seeds stored in the two packages was studied. Enzymatic mechanism of activities of a-amylase and LOX and gene relative expression affecting PSS was analyzed to provide reference to better store Triticum aestivum ssp. Yunnanense including Lincang hulled wheat. 【Method】Lincang hulled wheat seeds were put into vacuum sealed aluminum foil bag and into  non-sealed nylon mesh bags， stored at indoor temperature and relative humidity conditions in Kunming for 63，125，189，210，252 and 365 d. Then standardized germination test，3，5-dinitrosalicy-lic acid（3，5-DNSA），spectrophotometer and real time PCR（RT-PCR） were used to measure respectively seeds viability index，activities of a-amylase and LOX，and relative expression level（REL） of the seeds.The simple correlation analysis and stepwise regression were also conducted. 【Result】The results showed that the seeds packaged in vacuum sealed method still had very high viability indexes after storing 125 d，whose germination force（GF），germination percent（GP）， weigh-ted germination index（WGI），germination index（GI） and vigor index（VI） were 78.3%，96.7%，0.622，30.933，and 539.1 respectively. But for the seeds after storing 125 d with non-sealed package，GF，WGI and GI had very obvious decline，all the five viability indexes occurred cliff collapse when seeds were stored up to 189 d，only occupied by 14.9%-25.0% of those stored for 125 d.No obvious difference was found in the activities of a-amylase and LOX between seeds packaged by the two methods. The simple correlation and stepwise regression analysis between PSS and seeds viability index，activities of a-amylase and LOX，and REL of genes indicated that，under indoor temperature and relative humidity conditions in Kunming，PSS with non-sealed package way were shortened with increase of WGI and LOX activity，and increased with increase of a-amylase activities and REL of TaLOX3-4A. But PSS with vacuum sealed way was only increased with decrease of REL of a-amylase gene amy3. 【Conclusion】The seeds with vacuum sealed in aluminum foil bag have longer PSS and maintain high viability，because the PSS in this method is not altered with activity changes of a-amylase and LOX.

Key words： vacuum sealed package; Lincang hulled wheat seeds; a-amylase; lipoxygenase（LOX）; relative expression level of genes; viability

0 引言

【研究意义】铁壳麦是云南小麦亚种（Triticu-maestivum ssp. yunnanense）资源的俗称，是云南特有的普通小麦原始栽培类型，具有耐瘠薄、抗旱、抗穗上发芽及抗条锈病等优异特性，在选育抗逆性、绿色、优良小麦新品种的研究中具有一定的潜在利用价值。另外，因其具有栽培小麦的野生祖先，如乌拉尔图小麦、野生二粒小麦和节节麦等所特有的穗轴脆弱性（断穗）和黏壳（包壳）性，也是研究现代栽培六倍体小麦起源与演化的重要工具材料。目前，保存在国家种质库（49份）和云南省农业科学院种质库（65份）的铁壳麦资源，主要采集于20世纪70—80年代云南的12个县（市、区）。随着社会经济的发展及种植业结构的调整，这种小麦已从原来的种植或分布区内消失。因此，开展铁壳麦种质资源的保存技术研究并妥善保护好库存的种质样品，是保障该珍稀种质资源可能被持续利用的重要课题。【前人研究进展】目前，已有不少关于不同包装方法可能影响植物种子贮藏效果的研究报道。李雪峰等（2009）采用铝箔袋、镀铝袋和纸袋3种方法包装辣椒种子，在30 ℃恒温箱中贮藏4个月后，测得铝箔袋包装种子的发芽势和发芽率分别为63.3%和82.0%，而镀铝袋和纸袋包装的种子已完全丧失发芽能力。田宏等（2011）研究牛皮纸袋和玻璃瓶包装的扁穗雀麦种子在不同温度（室温、4 ℃、-10 ℃）贮藏3、6和12个月后的生活力，结果发现牛皮纸袋包装贮藏于-10 ℃的种子发芽率仍在90.0%以上，是保存扁穗雀麦种子的有效方法。李瑞云等（2012）测定了铝箔袋、铜版纸袋和罐装贮藏28个月后的黄瓜种子发芽率，结果发现3种包装方法的种子发芽率存在极显著差异，其中铝箔袋包装的种子发芽率最高。覃初贤等（2016）通过测定发芽力、电导率和田间成苗率来评价6种包装方法贮藏红麻种子的效果，结果显示，与初始发芽率88.0%相比，纸袋、布袋、薄膜袋和铝盒包装的种子在种质库贮藏31年后的发芽率为79.7%～81.3%，下降明显;而种子盒和玻璃瓶密封包装的种子发芽率仍保持在85.0%以上，是贮藏红麻种子的有效包装方法。冯佳强等（2017）研究真空透光和不透光两种方法包装贮藏的桔梗种子发芽势及发芽率，结果显示贮藏10个月后，真空透光包装的种子发芽势和发芽率分别为22.67%和31.33%，优于真空不透光的包装方法。【本研究切入点】上述前人的研究结果虽然已表明种子的发芽率、发芽势等生活力指标在不同包装贮藏方法间存在明显差异，且密封包装方法贮藏的种子能保持更高的生活力，但目前鲜见在相同贮藏环境下，密封和非密封包装贮藏方法通过影响小麦种子的a-淀粉酶和脂肪氧化酶（LOX）活性及其基因相对表达量，从而影响种子贮藏期限的研究报道。【拟解决的关键问题】以保存的临沧铁壳麦为试验材料，研究铝箔袋真空密封和尼龙网袋非密封包装方法贮藏的种子生活力指标、贮藏期、a-淀粉酶和LOX活性及其基因相对表达量之间的关系，了解a-淀粉酶和LOX活性及其基因相对表达量的变化影响种子贮藏期的酶学机制，为更好地保护临沧铁壳麦等云南小麦亚种资源提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为保存于云南省农业科学院作物种质库10年的云南临沧铁壳麦（保存编号云0006/XM0927）种子。3，5-二硝基水杨酸、亚油酸、磷酸、柠檬酸、氢氧化钠、硼酸和醋酸钠等试剂购于昆明宝赛科技有限公司。主要仪器设备：DRXM-508C-4型低温人工气候箱（宁波江南仪器厂）、DU-730紫外分光光度计[贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司]、QuantStudio6 Flex RT-PCR仪（美国ABI公司）。

1. 2 种子包装方法和贮藏处理

2016年1月取出种子，测得出库发芽率为91.0%，水含量11.2%。将其中约72 g种子以真空密封方法包装在6个铝箔袋（10 cm×15 cm）内，每袋约12 g种子，将另外约72 g种子装在不可密封的尼龙网袋内。两种方法包装的种子均被置于1—12月月均温度8.1～19.9 ℃、变幅-5～31 ℃，月均相对湿度72.4%、变幅在58.0%～83.0%及月均降水量11.3～204.0 mm的昆明室内贮藏63～365 d。

1. 3 貯藏后种子的生活力指标测定

贮藏后的种子发芽率等生活力指标，采用标准发芽方法（GB/T 3543.4—1995）测量。每次测量时，从真空密封方法包装的铝箔袋和非密封方法包装的尼龙网袋内分别挑选400粒饱满的种子，以每100粒为1次重复，共重复3次，置于无菌培养皿内，加淹没种子厚度一半的无菌水后，于（20±1）℃的人工气候箱内无光培养7 d。自浸泡种子的第2 d起，每天9时开始统计前一天的发芽种子数，并将发芽的种子挑选至塑料瓶（直径5 cm、高15 cm）内加盖保湿培养。发芽试验至第8 d时，每重复随机测量10株幼苗的苗高（芽长+根长，cm），并计算发芽势（GF）、发芽率（GP）、加权发芽指数（WGI）（Zhang et al.，2014;Barrero et al.，2015）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）5个生活力指标。

式中，N1、N2、N3…N7为第1、2、3…7 d发芽的种子数，Gi为第Di天发芽的种子数，S为平均苗高。

试验期一年，计划测量6次，每60 d测1次。但在测量贮藏189 d的种子生活力时，发现尼龙网袋非密封装的种子发芽率已大幅下降，而铝箔袋真空密封装的种子发芽率变化不明显，故补充测量了尼龙袋包装贮藏210 d的种子生活力指标。此外，在检测贮藏252 d的种子生活力时，发现非密封包装的种子大多数生活力指标已明显下降，个别指标如发芽势几乎降至0，故不再继续作检测。

1. 4 α-淀粉酶和LOX溶液的提取与活性评估

1. 4. 1 酶溶液提取 取上述发芽7 d的种子，吸干表面水分后摘除根芽，称取1 g置于研钵内，加2 mL蒸馏水研磨至匀浆，转至离心管，以4000 r/min离心10 min;取上清液，用蒸馏水标定至25 mL，获得α-淀粉酶原液。另取相同样品0.5 g放入研钵内，加1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.5），研磨成匀浆，置于4 ℃冰箱冷藏2 h后浸提2 h，12000 r/min离心10 min，获得LOX溶液60 μL。

1. 4. 2 α-淀粉酶和LOX活性评估

1. 4. 2. 1 α-淀粉酶活性 采用3，5-二硝基水杨酸法测定。在每支试管（其中1支为对照、另外3支为待测）中加入α-淀粉酶原液1 mL，70 ℃水浴15 min，取出用流水迅速冷却;向每支试管加入pH 5.6的柠檬酸缓冲液1 mL，另外在对照试管中加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，每支试管均40 ℃水浴15 min，然后分别加入在40 ℃下预热的1%淀粉溶液2 mL，摇匀后立即放入40 ℃水浴中保温5 min，迅速分别加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液4 mL;再从每支试管中取液2 mL转入25 mL试管，分别加入3，5-二硝基水杨酸2 mL，沸水浴5 min;取出冷却，以蒸馏水稀释至25 mL，采用紫外分光光度计测波长520 nm处吸光值。

单独配制每次发芽样品的麦芽糖标准溶液，建立α-淀粉酶标准液吸光值（y）与麦芽糖含量（x）的线性回归方程。然后将实测样品3次重复的吸光值均值与对照吸光值均值的差值（DA）代入方程，折算出麦芽糖含量，再由麦芽糖含量求得α-淀粉酶活性。本研究计算样品麦芽糖含量的线性回归方程如下：

y1=-0.021+0.265x（R2=0.995，P=0.006<0.01）

y2=-0.032+0.306x（R2=0.987，P=0.000<0.01）

y3=-0.021+0.283x（R2=0.997，P=0.000<0.01）

y4=-0.025+0.288x（R2=0.995，P=0.000<0.01）

y5=-0.027+0.276x（R2=0.994，P=0.007<0.01）

y6=-0.035+0.290x（R2=0.991，P=0.000<0.01）

式中，y1、y2、[y]3…y6分别为贮藏63、125、189、210、252和365 d后的样品吸光值，x的变化能解释98%以上的y变化（R2=0.987～0.995）。所以，由这些方程估算出的麦芽糖含量的可靠性均在98%以上。

1单位的α-淀粉酶活性为每克样品在孵化5 min后产生1 mg的麦芽糖含量。样品的α-淀粉酶活力（mg/g）=利用上述回归方程求得的麦芽糖含量（mg）×淀粉酶原溶液总体积（mL）/[样品重（g）×5 min×显色用酶液体积（mL）]。

1. 4. 2. 2 LOX活性 采用分光光度法度量。亚油酸底物为0.5 mL吐温20溶解于10 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液（pH 9.0）中，混匀，再逐滴加入0.5 mL亚油酸。混匀后，加入1.3 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液澄清，再加入90 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液（pH 9.0），用盐酸调节pH为7.0后定容至200 mL。反应体系为在4.75 mL 0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.6）中加入0.15 mL亚油酸底物和30 μL酶溶液。最后用分光光度计读取波长234 nm处吸光值。

1单位的LOX活性为在反应总体系中LOX在波长234 nm处1 min产生1光密度（Surrey，1964）。

1. 5 α-淀粉酶和LOX基因相对表达量的实时定量PCR检测

1. 5. 1 RNA提取、cDNA合成及其PCR扩增 取在上述发芽试验中生长7 d的幼苗叶片，按照宝生物工程（大连）有限公司生产的试剂盒（TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit）及反转录试剂盒（PrimeScriptTm ?? 1st Strand cDNA Synthesis Kit）使用指南，提取和检测RNA，合成并保存cDNA于 -20 ℃冰箱备用。采用该公司的生物试剂盒[SYBR? Premix Ex TaqTM（TIiRNaseH Plus）]进行cDNA扩增。反應体系20.0 ?L： SYBR? Premix Ex Taq（TIiRNaseH Plus）（2×）10.0 ?L、PCR Forward Primer（10 ?mol/L）0.4 ?L、PCR Reverse Primer（10 ?mol/L）0.4 ?L、ROX Reference Dye ??（50×）0.4 ?L、DNA模板2.0 ?L、ddH2O 6.8 ?L。PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，进行40个循环。

1. 5. 2 扩增临沧铁壳麦cDNA的PCR引物 扩增临沧铁壳麦cDNA的引物（表1）为小麦α-淀粉酶基因（amy1、amy3）（周飞，2011;Yang et al.，2014）及其内参基因（actin-wheat）引物（Niu et al.，2005），小麦LOX基因（TaLOX2-5DL、TaLOX3-4A）及其内参基因（26S rRNA）引物（Feng et al.，2012），由昆明森格玛生物科技有限公司合成。

1. 6 统计分析

利用IBM SPSS statistics 19单因素方差、双变量简单相关及逐步回归分析法分析获得的试验数据，基因相对表达量以[2-△Ct]（Li et al.，2017）表示，表示的相对表达量并被用于对生活力指标、贮藏期等计算简单相关系数和作为自变量参与对贮藏期的逐步回归分析。式中，△Ct=样品目标基因Ct值-内参基因Ct值。

2 结果与分析

2. 1 不同包装方法对临沧铁壳麦种子生活力的影响

在昆明室内温、湿度环境条件下，以真空密封和非密封两种方法包装贮藏63～365 d的临沧铁壳麦种子的加权发芽指数、发芽指数、发芽势、发芽率和活力指数5项生活力指标随贮藏期变化的趋势明显不同（图1）。真空密封（铝箔袋）包装种子的生活力指标在前4个贮藏期（63、125、189和252 d）中均无明显差异，贮藏至365 d时才明显下降。相反，非密封（尼网龙袋）包装的种子，在贮藏125 d后的加权发芽指数、发芽指数和发芽势及贮藏189 d后的发芽率和活力指數均明显下降，贮藏期至189 d时，加权发芽指数、发芽指数、发芽势、发芽率和活力指数分别仅为125 d时的21.1%、19.5%、25.0%、14.9%和16.8%，呈现出断崖式骤降。

图1显示，在相同贮藏期内，真空密封和非密封包装的种子在贮藏63 d后加权发芽指数和发芽率已存在显著差异（P<0.05，下同），真空密封包装的种子加权发芽指数和发芽率分别为0.638和92.3%，显著高于非密封包装种子（0.576和85.3%）;在贮藏125 d后，两种方法包装的种子发芽指数、发芽势和活力指数间也存在显著差异，且同样表现为真空密封包装的种子（30.933、78.3%、539.1）显著高于非密封包装的种子（22.433、28.0%、375.5）。贮藏至252 d时，非密封包装种子的5项生活力指标观测值均很小且接近于0，具体为加权发芽指数0.038、发芽指数1.832、发芽势2.3%、发芽率7.7%和活力指数7.1;但真空密封包装的种子仍保持较高的生活力，加权发芽指数、发芽指数、发芽势、发芽率和活力指数依次为0.654、33.533、86.0%、91.0%和500.0，与贮藏125 d相比，差异不明显。可见，真空密封包装方法能使种子保持较高的生活力。

2. 2 两种包装方法对临沧铁壳麦种子a-淀粉酶和LOX活性的影响

真空密封包装和非密封包装贮藏临沧铁壳麦种子的a-淀粉酶（图2-A）和LOX（图2-B）活性变化趋势一致，随着贮藏时间的延长，a-淀粉酶活性表现先下降后上升的变化趋势，LOX活性表现先下降后上升再下降的变化趋势。两种方法包装种子的a-淀粉酶活性在4个贮藏期之间均无显著差异（P>0.05，下同），其中非密封包装种子的a-淀粉酶活性在4个贮藏期分别为5.5、3.4、2.1和7.1 mg/g，真空密封包装种子分别为4.8、4.5、2.3和6.5 mg/g。真空密封包装种子的LOX活性在贮藏至63和189 d（3.2和3.7 mg/g）时显著高于相应贮藏期的非密封包装种子（2.7和3.2 mg/g），其他贮藏期之间的LOX活性则无显著差异。

2. 3 两种包装方法贮藏的临沧铁壳麦种子贮藏期与生活力指标、酶活性及基因相对表达量的关系

2. 3. 1 简单相关分析结果 简单相关分析结果（表2）表明，非密封包装种子的贮藏期与5项生活力指标均呈极显著负相关（P<0.01，下同），与amy3基因相对表达量呈显著负相关，与a-淀粉酶活性、LOX活性及amy1、TaLOX2-5DL和TaLOX3-4A基因相对表达量则无显著相关性，说明非密封包装种子的贮藏期主要受生活力指标及amy3基因相对表达量影响，并随生活力指标及amy3基因相对表达量的增加而变短。真空密封包装种子的贮藏期与发芽率和活力指数呈显著负相关，与amy3、TaLOX2-5DL和TaLOX3-4A基因相对表达量呈极显著负相关，与加权发芽指数、发芽指数、发芽势、a-淀粉酶和LOX活性及amy1基因相对表达量的相关性则不明显，说明真空密封方法包装的种子贮藏期主要受生活力指标的发芽率和活力指数及LOX基因相对表达量影响，并随两个生活力指标及3个基因相对表达量的增加而变短。

2. 3. 2 逐步回归分析结果 以种子贮藏期为因变量（y），生活力指标、酶活性及其基因相对表达量为自变量（x）进行逐步回归分析（表3），得到非密封包装贮藏的种子贮藏期回归方程y=174.587-291.544x1（加权发芽指数）-9.034x7（LOX活性）+5.633x6（a-淀粉酶活性）+4779.117x11（TaLOX3-4A基因相对表达量）。该方程的F=354.987，Sig.=0.000，具有统计学意义，决定系数R2=0.994，调整后R2=0.992，说明非密封包装贮藏种子的加权发芽指数、a-淀粉酶活性、LOX活性和TaLOX3-4A基因相对表达量对种子贮藏期有明显影响。这些指标的变化能解释贮藏期99%的变化。因此，非密封方法包装贮藏的种子贮藏期主要依赖于这4个自变量的变化而变化，与简单相关系数分析揭示的生物学信息不同。此外，该方程的常量及自变量的回归系数均达到0.05显著水平，说明方程的拟合性非常好。根据4个指标的标准系数，即对贮藏期的直接真实贡献率（通径系数），可看出种子的贮藏期与加权发芽指数的简单相关性是真实的（r=-0.966，标准系数-0.973，两者相当），而与a-淀粉酶、LOX活性及TaLOX3-4A基因相对表达量的相关性被夸大或缩小。其中，种子贮藏期与a-淀粉酶和LOX活性的相关系数分别被夸大了2.0倍和约1.4倍，与TaLOX3-4A基因相对表达量的相关系数则被缩小了46.0倍。

真空密封方法包装贮藏的种子贮藏期回归方程为y=328.127-43.031x9（amy3基因相对表达量）。方程的F=16.003，Sig.=0.002，也具有统计学意义，但R2及调整后的R2分别为0.552和0.518，说明amy3基因相对表达量变化只能解释种子贮藏期约50%的变化。种子贮藏期与amy3基因相对表达量的相关性（r=-0.770）和标准系数（-0.743）相当，说明amy3基因相对表达量对种子贮藏期的影响同样真实可靠。

因此，與非密封包装方法相比，真空密封包装方法贮藏的种子贮藏期变化与生活力指标、a-淀粉酶和LOX活性的变化无关，即在昆明室内温、湿度环境下，真空密封包装方法限制了加权发芽指数、a-淀粉酶和LOX活性对种子贮藏期的直接影响，比非密封包装方法有更长的使种子保持高生活力的贮藏期。

3 讨论

种子贮藏环境中的温、湿度及种子自身水含量等因素单独或综合影响着种子的生活力（Niane et al.，2013;辛霞等，2013;Petrenko，2014）和平衡水分。在一定温度和湿度条件下，种子自身水含量（初始水含量）会与其贮藏环境中的相对湿度发生互动，谋求水分平衡，也就是种子发生吸湿与解吸湿现象的过程。相同的种子在不同初始水含量、贮藏温度和相对湿度条件下的吸湿与解吸湿过程不同。已有研究表明，尼龙网袋（非密封）包装的初始水含量为8.0%的小麦种子贮藏在温度15、25、40 ℃和相对湿度≤18.8%，初始水含量为13.5%贮藏在15 ℃和相对湿度<48.1%，初始水含量为13.5%贮藏在25、40 ℃和相对湿度<18.8%，初始水含量为18.0%贮藏在温度15、25、40 ℃和相对湿度≤48.1%的环境下是解吸湿变化，在其他条件下则是吸湿变化（王婧等，2011）。在本研究中，贮藏临沧铁壳麦种子的温、湿度条件为年均最高气温20.8 ℃、最低气温10.3 ℃、变幅在-5～31 ℃范围内，降水总量1011.3 mm;历年（1971—2000年共30年）1—12月月均温度8.1～19.9 ℃，月均降水量11.3～204.0 mm，月均相对湿度72.4%，变幅在58.0%～83.0%的昆明室内环境。因此，尼龙网袋非密封包装贮藏在这种环境下的临沧铁壳麦种子（初始水含量11.2%）应呈吸湿变化，这种推测在贮藏试验结束后对剩余种子水含量的测定结果中得到证实。因为非密封包装的临沧铁壳麦种子在贮藏试验结束后的水含量为14.7%，较初始水含量增加了3.5%，而真空密封包装种子的水含量保持在11.5%左右，与初始水含量相当。

非密封方法包装贮藏的临沧铁壳麦种子在贮藏过程中为吸湿变化，加速呼吸和老化，消耗胚萌发需要的营养物质，导致种子生活力迅速下降直至死亡，故在贮藏125 d后，其加权发芽指数、发芽指数及发芽势均出现明显下降，分别只有贮藏63 d时的70.0%、76.0%和48.3%;且在贮藏189 d后，5项生活力指标也都出现断崖式减少。而真空密封方法包装的种子，由于铝箔袋阻挡了种子与湿空气直接接触，减轻了种子水含量随空气相对湿度变化的程度，并限制袋内氧离子活动，延缓种子脂肪的氧化速率和衰老，故在贮藏125和189 d后仍保持着较高的生活力水平，其加权发芽指数、发芽指数、发芽势、发芽率和活力指数依次为0.622和0.634、30.933和32.967、78.3%和79.7%、96.7%和92.3%、539.1和548.0，分别是非密封包装贮藏相同时间种子的1.5和7.5、1.4和7.5、2.8和11.3、1.1和7.5、1.4和8.7倍。

在任意贮藏期内，真空密封方法包装种子的5项生活力指标均高于非密封包装，但其a-淀粉酶和LOX活性并非都高于非密封包装的种子。因此，贮藏后临沧铁壳麦种子的α-淀粉酶活性随种子生活力指标变化趋势与杂交稻种子的α-淀粉酶活性变化随种子活力的变化趋势一致（林程等，2017）不同。虽然真空密封和非密封方法包装贮藏临沧铁壳麦种子的a-淀粉酶、LOX活性与5项生活力指标的相关性不明显（相关系数为-0.044～0.230和-0.081～0.234、 -0.304～-0.469和-0.300～0.414），但逐步回归分析结果表明，非密封方法包装种子的贮藏期随加权发芽指数、a-淀粉酶和LOX活性、TaLOX3-4A基因相对表达量的变化而变化，这4个因素的变化能解释种子贮藏期变异的99%。LOX基因TaLOX3-4A的相对表达量能延长种子的贮藏期，与Long等（2013）在水稻中观测到的LOX基因sLOX3过量表达对种子寿命有负影响的结果不一致，原因有待进一步探究。在真空密封方法包装的种子中，种子贮藏期只与a-淀粉酶基因amy3的相对表达量有密切关系，回归系数为-43.031，说明amy3基因相对表达量越高，种子的贮藏期越短，而加权发芽指数、a-淀粉酶和LOX活性没有或很少影响种子的贮藏期，也就是说铝箔袋真空密封方法包装的种子，其贮藏期的变化与生活力指标及a-淀粉酶和LOX活性变化无明显关联。

已有研究表明，温度能明显改变种子的a-淀粉酶（Biddulph et al.，2008;万中原等，2013;刘美等，2014）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）（Biddulph et al.，2008;廖乐等，2015）、LOX（Tamás et al.，2009;Kosakivska et al.，2014;张福彦等，2016）的活性及其基因相对表达量，而酶活性的改变，尤其是LOX，又能明显影响种子的生活力（Long et al.，2013;Dong et al.，2015）。本研究结果表明，在相同温度条件下，不同包装方法可能引起种子的水含量变化，并导致种子的a-淀粉酶、LOX活性及其基因相对表达量发生变化，而这两种酶的活性及表达量变化又强烈地影响着种子的贮藏期变化。

4 结论

在昆明室内温、湿度条件下，铝箔袋真空密封包装贮藏的临沧铁壳麦种子较尼龙网袋非密封包装的种子有更高的生活力和更长的贮藏期，是因为真空密封包装方法改变了种子贮藏期依赖于a-淀粉酶和LOX活性变化的关系，从而降低了a-淀粉酶和LOX活性对种子贮藏期的直接影响。

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