云南切梢小蠹热激蛋白20基因克隆及序列分析

杨诚 许玉 刘霞

摘要：【目的】对云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）成虫热激蛋白20基因（TynHSP20）进行克隆和序列分析，为研究该虫在高温环境下的抗逆机制打下基础。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆云南切梢小蠹成虫TynHSP20基因cDNA序列，并对其序列进行生物信息学分析。【结果】克隆获得的TynHSP20基因cDNA序列长671 bp，含開放阅读框597 bp，5'端非编码序列和部分3'端非编码序列分别为44和33 bp。该基因编码198个氨基酸，预测蛋白质分子量为22.50 kD，等电点为7.86，包含一个保守的α-晶体蛋白结构域。同源性比对分析结果表明，TynHSP20蛋白氨基酸序列与东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇的HSP20氨基酸序列相似性均低于20%。系统发育分析结果显示，TynHSP20与沙葱萤叶甲的亲缘关系较近。【结论】成功克隆获得TynHSP20基因cDNA序列，该基因具有小热激蛋白家族的特征，但与其他物种小热激蛋白的同源性较低。

关键词： 云南切梢小蠹;HSP20基因;基因克隆;序列分析;系统发育进化树

中图分类号： S763.3                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2425-07

Cloning and sequence analysis of heat shock protein 20 gene （TynHSP20） from Tomicus yunnanensis（Coleoptera：Scolytidae）

YANG Cheng， XU Yu， LIU Xia*

（College of Biodiversity Conservation and Utilization， Southwest Forestry University/Yunnan Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control， Kunming  650224， China）

Abstract：【Objective】Cloning and sequence analysis of heat shock protein 20 gene（TynHSP20） from adult Tomicus yunnanensis were conducted to form molecular basis for the research on anti-adversity mechanisms of T. yunnanensis under high temperature environment. 【Method】The cDNA sequence of TynHSP20 gene from adult T. yunnanensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends technique（RACE） and bioinformatics analysis was conducted. 【Result】The obtained TynHSP20 gene cNDA sequence by cloning was 671 bp in length， which contained an open reading frame of 597 bp;thenoncoding sequences of 5'-end and a part of 3'-end were 44 and 33 bp respectively. TynHSP20 gene encoded 198 amino acids， with the predicted protein molecular weight of 22.5 kD and isoelectric point of 7.86， containing a conserved α-crystallin domain. Homology comparison analysis indicated that T. yunnanensis TynHSP20 protein amino acid sequence shared low（below 20%） similarity with the HSP20 amino acid sequence of Locusta migratoria， Gastrophysa atrocyanea， Spodoptera litura and Liriomyza sativae. The result of phylogenetic analysis showed that TynHSP20 had the clo-sest genetic relationship with Galerucadaurica. 【Conclusion】The TynHSP20 gene cDNA sequence is successfully obtained by cloning. TynHSP20 gene has the characteristic of small heat shock protein family， and has relatively low homology with the small heat shockprotein of otherspecies.

Key words：Tomicus yunnanensis; TynHSP20; gene cloning; sequence analysis; phylogenetic tree

0 引言

【研究意义】热激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）又称热休克蛋白或应激蛋白（Heat stress protein），属分子伴侣家族，广泛分布于动植物和微生物体内，在进化上高度保守（马文静和马纪，2012;司风玲等，2016）。热激蛋白除作为分子伴侣外，当机体受到高温、高压、低温、缺氧、紫外线、病原体感染、组织损伤、某些重金属离子等不利环境或条件胁迫后，生物体通常大量表达该蛋白，从而起到抗胁迫的作用（孫卫忠等，2003;张莉和刘吉平，2006;王建义和慈忠玲，2008）。此外，热激蛋白还参与靶蛋白活性和功能的调节，主要涉及蛋白质的折叠、装配、跨膜转导等多种生物进程，对蛋白质在生物体的平衡具有重要作用（姜建军等，2015;史彩华等，2017;Wu et al.， 2017）。依据热激蛋白分子量、氨基酸序列和功能，可将其分为HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子热激蛋白（Small heat shock protein， sHSP）（Gkouvitsas et a1.， 2009），其中，sHSP在生物体内分布最广、保守性最低，其分子量在12～43 kD，具有分子伴侣活性，可在环境胁迫下帮助蛋白质折叠和转运（张莉和刘吉平，2006;夏佳音和张耀州，2007;刘鹏等，2017）。当机体受到刺激源刺激时会导致蛋白质变性，部分变性的蛋白质以一种不稳定的状态结合到sHSP上形成sHSP底物复合物，以避免集聚;当恢复正常状态后，部分变性蛋白从sHSP上解离下来，重新折叠成正确构象（李雯，2009）。sHSP在昆虫对温度胁迫的耐受性方面扮演着重要角色，同时在昆虫生长发育过程中发挥重要作用，如高温和低温胁迫下华山松大小蠹成虫体内sHSP基因表达变化显著（石琦，2016），葱蝇DaHSP23基因在其冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达（司风玲等，2016）。因此，对sHSP基因进行深入研究，除了具有阐明sHSP蛋白在昆虫应对高温胁迫中的理论意义外，还有助于揭示昆虫与环境信息交流的机制，为探索昆虫抗逆性的分子机制打下基础。【前人研究进展】从原核生物到真核生物，sHSP已被证实在C末端有一段80～100个残基的保守结构域——α-晶体蛋白结构，可通过温度依赖性结构的变化增加其表面疏水性（于可明等，2009）。正常情况与应激状态下，sHSP均参与复杂而重要的生物学过程，如当机体受到刺激时sHSP对细胞损害的抵抗力增强，加速异常蛋白的降解，阻止蛋白间不必要的相互作用并帮助变性蛋白重新折叠（Haslbeck，2006）。目前，有关昆虫sHSP基因的研究主要集中在基因克隆和定量表达等方面，罗素娟等（2010）克隆了家蚕（Bombyx mori）HSP23.7基因，并对该基因在家蚕5龄幼虫不同组织的表达情况进行分析，结果发现其在卵巢中表达量最高;孙涛等（2016）在白蜡虫（Ericerus pela）泌蜡高峰期共鉴定到32个热激蛋白非重复序列基因（Unigene），其中包含1个特异性的HSP20基因，且其相对表达量能被高温诱导;刘鹏等（2017）鉴定获得舞毒蛾（Lymantria dispar）6个小分子热激蛋白家族基因，并明确了smHSP基因对杀虫剂甲萘威胁迫的响应。云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）属鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹属（Tomicus），是严重危害云南松的次期性蛀干害虫，主要分布在我国的西南地区（叶辉，2011;Zhu et a1.， 2012;王军辉，2015）。该虫在云南地区每年发生一代，4—12月为蛀梢期，新羽化的成虫喜食嫩梢，一般只选择健康的云南松梢补充营养;12月—翌年3月为蛀干期，性成熟的成虫只选择树势衰弱的云南松树干作为繁殖场所（Lieutier et al.，2015）。该虫自20世纪80年代在云南中部大发生以来，现已扩散至四川等地，累积因云南切梢小蠹为害致死的云南松林面积高达20万ha（Lieutier et al.， 2015），给云南松林产业造成巨大经济损失，阻碍了松林产业的可持续发展及生态文明建设（王晓渭等，2014;俞琳锋等，2017）。目前，国内外有关云南切梢小蠹的研究主要集中在生态学和生物学等方面。吕军等（2010）通过控制云南切梢小蠹蛀干密度，首次探讨了自然条件下该害虫的蛀干行为与危害情况;岳锋等（2011）探讨了云南松纯林和云南松与藏柏、樟树、滇青冈、旱冬瓜、麻栎等树种以块状混交、行间混交、株间混交等方式的混交林对云南切梢小蠹的抗性，结果表明，混交林对云南切梢小蠹的抗性强于云南松纯林，云南松与藏柏和滇青冈混交林抗虫性好，不同混交方式的抗虫性以株间混交最好，行间混交次之，块状混交较差。【本研究切入点】目前，关于云南切梢小蠹分子生物学方面的研究较少，其中sHSP是研究相对较少的一类蛋白质分子。【拟解决的关键问题】采用cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆云南切梢小蠹成虫TynHSP20基因cDNA序列，并进行生物信息学特征分析，为研究该虫在高温环境下的抗逆机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

在云南切梢小蠹为害较严重的曲靖云南松林区（曲靖市沾益区九龙山林场）选择正在枝梢内取食的切梢小蠹带回实验室，剖开松枝，取出活成虫，依据鞘翅斜面第二沟间部有无颗瘤、刻点排列方式等特征鉴定云南切梢小蠹（Kirkendall et al.， 2008;李霞等，2012）。将成虫迅速放入装有TRIzol试剂的PE管中，并将PE管及时放在冰盒内，于-70 ℃保存备用。

主要试剂及仪器设备：TRIzol? Reagent购自Invitrogen公司;SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司;pGEM?-T载体购自Promega公司;PCR仪Veriti96型（Applied Biosystems）;高速冷冻离心机5804R型（Eppendorf）;超微量紫外分光光度计（Thermo）;移液枪（Eppendorf）;凝胶成像仪GBOXiChemi型（Syngene）;电泳仪（北京市六一仪器厂）;电泳槽（北京市六一仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 总RNA提取 操作步骤：（1）将已制备好成虫材料的PE管放在冰盒上，待融化后加入200 μL TRIzol试剂，用电动研磨器充分研磨至粉末状，加TRIzol补足至1.0 mL;（2）室温下静置5 min后，加入0.2 mL氯仿，用漩涡振荡仪剧烈振荡15 s，静置5 min后离心15 min（4 ℃，12000 r/min）;（3）保留上清液并移至新的无RNase的1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，轻轻吹打混匀，室温静置10 min后离心10 min （4 ℃，12000 r/min）;（4）弃上清液，在沉淀中加入1.0 mL 75%乙醇，轻轻振荡混匀，离心5 min（4 ℃，7600 r/min）;（5）弃上清液，室温干燥后加入适量DEPC水溶解，所得产物即为总RNA。总RNA经分光光度法测定其含量和纯度后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1. 2. 2 TynHSP20基因5'-RACE扩增 RACE-PCR参照陈德富和陈喜文（2006）的方法，以抽提的云南切梢小蠹成虫总RNA为材料，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit合成5'-RACE cDNA模板。根据实验室前期对云南切梢小蠹cDNA文库测序获得的HSP20基因3'-端序列，用Primer Premier 5.0设计5'-RACE-PCR特异性引物（5'-AGTAACGTG

ATTGGTGAG-3'），参照RACE试剂盒说明进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带切胶回收并纯化，用TA克隆法连接到pGEM?-T 载体上，并在42 ℃热激90 s后转化至DH5α感受态细胞。在X-Gal和IPTG诱导下，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆送至金思特科技（南京）有限公司测序。

1. 2. 3 序列分析 采用SeqMan将测序获得的HSP20核苷酸序列进行拼接，BLASTx进行序列同源比对分析，利用在线软件ORF Finder预测开放阅读框（Opening reading frame，ORF），SignalP 4.1 Server进行信号肽预测，Motifscan进行结构域预测，DNAMAN预测其分子量及等电点，运用Genetyx-MIN 5.1将其基因核苷酸序列推导成氨基酸序列，ClustalX 1.83和Gene-Doc进行多序列比对，使用MEGA 5.0中的邻接法（Neighbour Joining，N-J）构建不同昆虫HSP20基因氨基酸序列的系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 TynHSP20基因克隆与序列分析结果

5'-RACE扩增后，目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收，连接至pGEM?-T载体后，随机挑取20个阳性克隆进行测序，结果通过BLASTx比对分析，发现仅有1条为HSP20基因序列。将已知的3'端序列和5'-RACE扩增所得目的基因片段拼接后，即获得云南切梢小蠹TynHSP20基因（GenBank登录号：MH67434）序列671 bp，ORF为597 bp，5'端非编码序列和部分3'端非编码序列分别为44和33 bp（图1）。该基因编码198个氨基酸，预测分子量和等电点分别为22.50 kD和7.86。结构域分析结果表明，TynHSP20蛋白的氨基酸序列中有一个依赖于3'-5'-环化核苷酸蛋白激酶磷酸化位点（RKIS150-153）、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（TSTE88-91、SKFE144-147和SIPE153-156）和2个蛋白激酶磷酸化位点（STR30-32和TYK166-168）。对TynHSP20蛋白的氨基酸组成进行分析发现，其极性氨基酸含量占62.6%，预测该蛋白具有较强的亲水性。

BLASTp比对分析结果显示，TynHSP20蛋白包含一个保守的α-晶体蛋白结构域（α-crystallin）（图2），属于12～43 kD的sHSP家族。该家族成员作为分子伴侣时不依赖ATP，以形成大的聚合物形式行使其功能，能阻止蛋白质聚集并与其他热激蛋白共同参与蛋白质的正确折叠。利用SignalP 4.1 Server进行信号肽预测，结果显示该蛋白不具有信号肽（图2）。

2. 2 TynHSP20蛋白同源性分析结果

在NCBI中搜索東亚飞蝗（Locusta migratoria）、蓼蓝齿胫叶甲（Gastrophysa atrocyanea）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）等昆虫的HSP20蛋白氨基酸序列进行比对分析，结果显示TynHSP20蛋白与东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇的HSP20蛋白的氨基酸序列相似性不高，分别为11%、13%、15%和16%，均低于20%（图3）。为研究TynHSP20蛋白与其他物种间的进化关系，采用N-J法构建系统发育进化树。由图4可看出，不同物种HSP20蛋白被明显分为2个分支，即鳞翅目聚为一支，直翅目、双翅目和鞘翅目聚为一支，其中云南切梢小蠹与同为鞘翅目的沙葱萤叶甲亲缘关系较近。

3 讨论

随着全球气候变暖及极端高温天气的不断出现，昆虫对高温天气的耐热性及其机理已成为近年来昆虫学研究领域的热点问题（马罡和马春森，2016）。昆虫作为典型的变温动物，其对体内温度的维持和调节能力较弱，环境温度是影响昆虫生命活动的重要因素（史彩华等，2017）。多种逆境条件（如高温、低温、干旱和涝害等）均可诱导sHSP基因的表达，说明sHSP是昆虫应对逆境的重要应激蛋白，与昆虫的抗逆性密切相关（周永刚等，1996）。大部分昆虫的HSP20基因在机体受到温度胁迫时发挥重要抗胁迫功能，如从二化螟中分离鉴定出的HSP20基因在进行高低温刺激后检测发现其表达量均明显增加（Lu et al.， 2014）;Liu等（2014）在前期研究中发现白蜡虫HSP20对温度变化敏感，进一步推测其在白蜡虫2龄雄虫对温度耐受性的适应中发挥重要作用（孙涛等，2016）。

本研究以云南切梢小蠹为对象，利用RACE技克隆获得该害虫的TynHSP20基因，生物信息学分析发现，其ORF序列长度为597 bp，编码198个氨基酸，系统发育进化分析结果显示，TynHSP20与沙葱萤叶甲的亲缘关系较近。亲、疏水性是由蛋白的氨基酸序列决定，TynHSP20的亲水性强反映其极性氨基酸数量较多，是具有分子伴侣活性sHSP的基本特征，这一性质可帮助sHSP形成大寡聚体而不会聚集沉淀（Haslbeck，2006）。含有信号肽的蛋白质一般能被分泌到细胞外，本研究使用SignalP 4.1蛋白质信号肽预测工具分析结果表明TynHSP20蛋白不具有信号肽。

sHSP的主要结构由N端域和C端域两部分组成，C端域含有一个相当保守的α-晶体蛋白结构域，是sHSP家族成员所共有的结构域，在同物种sHSP间高度保守，甚至在不同物种间也具有很高的保守性（夏佳音和张耀州，2007）;N端域在同一物种间具有相对保守性，而在不同物种间无保守性，多变的N端域能调节低聚反应，其与形成大的低聚体复合物及伴侣活性有关（Kundu et al.， 2007）。N端域和C端域在序列上高度可变，且这两部分对于sHSP形成寡聚体结构及发挥功能至关重要。本研究结果显示，云南切梢小蠹TynHSP20蛋白包含一个保守的α-晶体蛋白结构域，但C末端并不齐全，缺少部分尾巴poly（A）序列。sHSP是一个极多样的群体，不同的组织有着不同数目的sHSP，如从啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单一的sHSP到高等植物的30多种sHSP（Kitagawa et al.，2000;Tada et al.，2000）;在分子量上也存在明显差异，如从线虫的16 kD到原生动物血吸虫（Schistosoma mansoni）的40 kD（Kanamura et al.，2002;Hartwig et al.，2009），甚至在同种内也可观察到其多样性，以及在序列上具有的差异。本研究通过同源序列多重比对分析发现，TynHSP20蛋白氨基酸序列与4个已报道的其他昆虫（东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇）的HSP20氨基酸序列间具有一定的保守性，但相似性很低，与前人的研究结果相似，即不同物种之间小热激蛋白序列相似性一般都很低（Taylor and Benjamin，2005）。本研究克隆云南切梢小蠹TynHSP20基因并对其进行生物信息学分析，为进一步探讨HSP20基因的抗逆性机制打下基础，但有关该基因对温度变化的响应与调控作用还需进一步的研究证实。

4 结论

云南切梢小蠹TynHSP20基因C端域含有α-晶体蛋白，具有12～43 kD小热激蛋白家族的特征，序列同源性分析结果表明HSP20基因具有较低的保守性。本研究为了解云南切梢小蠹小热激蛋白的生物功能提供了分子基础，对下一步研究该蛋白的功能具有重要意义。

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