热带念珠菌β—葡聚糖合成酶KRE9基因原核表达及其比活力测定

刘政伟 李瑞芳 张瑞玲

摘要：【目的】原核表达热带念珠菌（Candida tropicalis MYA-3404）β-葡聚糖合成酶（KRE9），并进行酶比活力测定，为研究其结构和生物学功能提供参考。【方法】提取热带念珠菌DNA，PCR扩增KRE9基因，构建其原核表达载体pET28a-KRE9后转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞，通过IPTG诱导表达及组氨酸（His）标签纯化树脂亲和柱纯化获得融合蛋白KRE9，并利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色法测定其比活力。【结果】克隆获得的KRE9基因全长816 bp，编码271个氨基酸，与参考基因序列（GenBank登录号XM_002547984）的相似性高达99.75%。将其原核表达载体pET28a-KRE9转化大腸杆菌BL21（DE3）感受态细胞，通过诱导表达及纯化获得重组蛋白KRE9，经SDS-PAGE检测，发现其纯度较高，大小约35 kD。Western blotting鉴定结果显示，重组蛋白KRE9能与抗His抗体发生特异性结合。重组蛋白KRE9比活力为9.169×104 U/mg。【结论】重组蛋白KRE9具有良好的特异性和较高β-葡聚糖合成酶活性，可用于其结构和生物学功能研究。

关键词： β-葡聚糖合成酶（KRE9）；热带念珠菌；原核表达；纯化；比活力

中图分类号： S154.39 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0628-07

Gene prokaryotic expression and specific activity determination of β-glucan synthase KRE9 in Candida tropicalis

LIU Zheng-wei， LI Rui-fang*， ZHANG Rui-ling

（College of Biological Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China）

Abstract：【Objective】β-glucan synthase KRE9 of Candida tropicalis MYA-3404 was expressed and purified， and its specific activity was analyzed， in order to provide reference for the study on the structure and biological function of β-glucan synthase KRE9. 【Method】The DNA of C. tropicalis was extracted， gene KRE9 was amplified by PCR， and prokaryotic expression vector pET28a-KRE9 was constructed. Competent cell of Escherichia coli BL21（DE3） was transfered.Fusion protein KRE9 was obtained by induction of IPTG as well as histidine（His） tag purificationof resin affinity chromatography， and its specific activity was determined by 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS） colorimetricmethod. 【Result】The cloned gene KRE9 was 816 bp in total length， encoding 271 amino acids. The sequencing results showed that gene KRE9 was highly similar to reference genes（GenBank accession number XM_002547984）， which reached 99.75%. The prokaryotic expression vector pET28a-KRE9 was transformed into competent cell of E. coli BL21（DE3）. Then the recombinant protein KRE9 was obtained by induction and purification. SDS-PAGE detection results showed that the recombinant proteins was 35 kDa with high purity.Western blotting identification indicated that there was specific binding between purified recombinant protein KRE9 and His antibody. The specific activity of KRE9 was 9.169×104 U/mg. 【Conclusion】Recombinant protein vegetable proteinis of fine specificity and high β-glucan synthase activity，and it can be used for its structural and biological function research.

Key words： β-glucan synthase（KRE9）； Candida tropicalis； prokaryotic expression； purification； specific activity

0 引言

【研究意义】热带念珠菌（Candida tropicalis）在农业生产中应用广泛，通过叶面喷施可促进农作物生长，减少白虱和蓟马侵染，使农作物产量明显增加（Gomaa et al.，2005；Mekki and Ahmed，2005；Amprayn et al.，2012），也可与单胞菌混合降解农作物秸秆，为发酵生产乙醇提供原料（Patle and Lal，2007）。此外，在热带念珠菌培养基中加入CuSO4能促进其分泌金属硫蛋白，说明其可应用于重金属污染土壤的生物修复（Radi? et al.，2017）。在热带念珠菌细胞壁合成过程中需要细胞壁合成蛋白即β-葡聚糖合成酶（KRE9），其在β-葡聚糖合成、细胞正常生长发育和维持细胞骨架方面发挥重要作用（Lesage and Bussey，2006），KRE9缺失会导致热带念珠菌死亡。因此，开展热带念珠菌KRE9基因表达及比活力测定的相关研究对揭示KRE9生物学功能具有重要意义。【前人研究进展】目前，β-葡聚糖合成的相关基因包括KRE5、BIG1、ROT1、KRE6、SKN1、KRE9和KNH1（Le-sage and Bussey，2006）。其中KRE9基因编码蛋白是细胞壁β-葡聚糖的合成途径中关键催化酶（Lussier et al.，1998）。Mata（2013）研究发现，KRE9可能与在肝脏内皮对微生物分子如脂多糖或甘露聚糖的促炎反应中起关键作用的细胞因子IL-1β受体活化有关。Mostert和Divol（2014）从酿酒酵母发酵过程中的蛋白质组中分离获得KRE9蛋白。Weber（2014）发现了一个与KRE9蛋白具有高度同源性的SUP11蛋白，其具有催化合成β-葡聚糖的生物学功能。张萍等（2016）研究发现，Snf1Δ突变株中KRE9基因的表达量降至野生型的0.49倍，严重影响了酵母细胞的正常生长。He等（2017）研究发现，KRE9是酵母活性至关重要的甘露糖基转移酶（PMT）的作用靶点，KRE9缺失或破坏均会导致PMT功能丧失，影响细胞的正常生长。Pan等（2017）研究发现，在酵母孢子壁形成过程中，KRE9对孢子壁的形成发挥重要作用。【本研究切入点】目前，虽然已有学者从基因水平开展了KRE9的相关的研究，但鲜见其原核表达及酶活性测定的研究报道。【拟解决的关键问题】以热带念珠菌为研究对象，通过分子克隆和原核表达得到KRE9蛋白，并对进行酶比活力测定，以期为研究其结构和功能提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 菌种与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、E. coli BL21（DE3）、原核表达载体pET28a和热带念珠菌（C. tropicalis MYA-3404）由河南工业大学生物工程学院9335实验室保存提供。

1. 1. 2 培养基 大肠杆菌培养基LB的配制参照薛正莲和张珂等（2013）的方法，且加入卡那霉素（Kan），终浓度为10 μg/mL（薛雯雯，2010）；热带念珠菌SD培养基的配制参照陆志方（2016）的方法。

1. 1. 3 工具酶和生化试剂 限制性内切酶Hind III、BamH I和Protein Marker購自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq PCR Master Mix和DNA Marker S Plus购自生工生物工程（上海）股份有限公司；λDNA/Hind III Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；IPTG和Kan购自北京索莱宝科技有限公司。

1. 1. 4 主要仪器设备 MG型PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪（美国Bio-Rad公司）、紫外凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）和可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 引物设计 根据MALDI-TOF-MS分析结果，在GenBank上搜索获得KRE9基因序列（GenBank登录号XM_002547984），长度为816 bp，利用Primer Premier 5.0设计引物（翟中会等，2008）。KRE9-F：5'-CTGGATCCATGAGATTCTTT-3'（下划线为BamH I酶切位点）；KRE9-R：5'-ACAAGCTTTTACTAATCTA

ACCA-3'（下划线为Hind III酶切位点），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增片段长度为832 bp。上、下游引物分别稀释成10 μmol/L备用。

1. 2. 2 DNA提取 参照周小玲等（2004）的方法提取热带念珠菌DNA，-20 ℃保存备用，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 3 PCR扩增 以热带念珠菌DNA为模板，PCR扩增KRE9基因。PCR反应体系50.0 μL，包括Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒回收目的基因片段，-20 ℃保存备用。

1. 2. 4 重组质粒pET28a-KRE9构建 参照质粒提取试剂盒说明从含pET28a质粒的大肠杆菌DH5α中提取pET28a质粒，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。分别用BamH I和Hind III双酶切pET28a质粒和KRE9基因，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，分别用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行目的条带回收纯化，并将二者用T4 DNA连接酶于16 ℃下过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞。取200.0 μL菌液涂布于LB固体培养基（含10 μg/mL Kan）上，37 ℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，初步筛选出阳性克隆。将阳性克隆接种于10.0 mL LB液体培养基（含10.0 μg/mL Kan）中，37 ℃下220 r/min振荡培养过夜。最后用质粒提取试剂盒提取重组质粒，经BamH I和Hind III双酶切鉴定后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果正确的重组质粒pET28a-KRE9即为KRE9基因原核表达载体（图1）。

1. 2. 5 原核细胞诱导表达 参照汪家政和范明（2001）的方法进行诱导表达：将重组质粒pET28a-KRE9转化BL21（DE3）感受态细胞获得重组菌株，取100.0 μL菌液涂布于LB固体培养基（含10 μg/mL Kan）上，37 ℃倒置培养过夜。以含pET28a质粒的大肠杆菌BL21（DE3）为对照菌株。

1. 2. 6 SDS-PAGE检测 取诱导表达后的菌液，6000 r/min离心5 min收集菌体，用预冷的无菌PBS缓冲液清洗菌体3～5次，再用20.0 mL预冷的无菌PBS缓冲液重悬菌体，加入苯甲基磺酰氟（PMSF）至其终浓度为1 mmol/L（顾春银和张震宇，2014），超声波破碎菌体后，4 ℃下12000 r/min离心10 min，收集上清液和沉淀。取80.0 μL上清液和沉淀分别置于灭菌EP管中，各加入20.0 μL 5×SDS Loading Bu-ffer，100 ℃加热变性10 min。用16% SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。

1. 2. 7 重组蛋白KRE9纯化 重组菌株于20 ℃ 150 r/min培养20 h，收集菌体。菌体用无菌PBS缓冲液清洗3次，再用无菌PBS缓冲液重悬，冰浴条件下进行超声波破碎，直至无明显菌体，12000 r/min离心20 min，收集上清液。参照Ni-NTA琼脂糖凝胶（His标签纯化树脂）6FF说明纯化重组蛋白KRE9：将收集的上清液加入以5倍体积无菌PBS缓冲液平衡的His标签纯化树脂亲和柱中，然后用10个柱体积的Washing Buffer（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑）冲洗层析柱，最后用Elution Buffer（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑）洗脱，采用紫外分光光度计测定其在波长为280 nm处的吸光值，以检测收集目的蛋白峰。将含有目的蛋白的洗脱液合并，充分透析后-80 ℃冷冻保存。

1. 2. 8 Western blotting鉴定 将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，并切下目的条带，电转移至硝酸纤维素（NC）膜上，用3%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Anti-His单克隆抗体，4 ℃过夜（魏春红，2012）。最后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，室温摇床上孵育1 h后用二氨基联苯胺（DAB）底物显色试剂盒显色。

1. 2. 9 重组蛋白酶比活性测定 参照王卫国（2012）的方法测定重组蛋白KRE9的比活力：以葡萄糖为酶促反应底物，用3，5-二硝基水杨酸（DNS）为显色剂，测定KRE9催化合成β-葡聚糖所消耗的葡萄糖量，计算KRE9比活力。

1. 2. 9. 1 制作葡萄糖溶液标准曲线 配制浓度为80、160、240、320、400和480 μg/mL的葡萄糖待测液，分别取2.0 mL加入1.5 mL二硝基水楊酸（DNS）试剂，沸水浴10 min，冷却后加蒸馏水定容至25.0 mL，用可见光分光光度计测定在540 nm处的吸光值（OD540 nm）。每个浓度3个重复。最后以葡萄糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖溶液标准曲线。

1. 2. 9. 2 KRE9比活力测定 将6.0 mL葡萄糖溶液25 ℃预热10 min后与6.0 mL溶于蒸馏水的重组蛋白KRE9溶液混合，使葡萄糖终浓度为25 mg/mL，KRE9终浓度为10 μg/mL。以100 ℃加热变性10 min的KRE9溶液为对照。混合液平均分成6份，40 ℃下酶促反应时间分别设为10、20、30、40、50和60 s，反应结束后立即向酶促反应液中加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷却后加蒸馏水定容至25.0 mL，用可见光分光光度计测定在540 nm处的吸光值。根据葡萄糖标准曲线确定KRE9在合成β-葡聚糖反应中单位时间内所消耗的葡萄糖的含量，从而计算出其比活力（1 mg酶蛋白具有的酶活力单位，X），计算公式如下：

X（U/mg）=W/（T×M）

其中，W为反应消耗的葡萄糖质量（μg），T为反应时间（min），M为待测样品质量（mg），U为1 min消耗1 μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2. 1 KRE9基因原核表达载体构建结果

提取的热带念珠菌DNA用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，约在20 kb处有一条明亮条带，与预期结果一致（图2）。以KRE9-F/KRE9-R为引物，热带念珠菌DNA为模板进行PCR扩增，获得约800 bp的条带，与预期长度相符（图2）。将目的片段连接至pET28a载体，并用BamH I和Hind III进行双酶切鉴定，结果显示，双酶切产物中小片段长度约800 bp的条带，与KRE9基因长度基本一致（图2），说明KRE9基因已成功连接至pET28a载体上。

将双酶切鉴定呈阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证，测序结果经DNAMAN多序列比对分析，发现PCR扩增获得的KRE9基因长度为816 bp，编码271个氨基酸，与其参考基因序列（GenBank登录号XM_002547984）相似性高达99.75%（图3），说明成功构建了KRE9基因的原核表达载体pET28a-KRE9，可用于蛋白诱导表达分析。

2. 2 KRE9基因原核表达及纯化结果

重组菌株经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测，结果显示，与对照菌株的裂解上清液和沉淀相比，重组菌株的裂解上清液和沉淀中含一条特异性目的蛋白条带，约35 kD，与预期结果相符，表明其可能是融合蛋白KRE9（图4）。利用His标签纯化树脂亲和柱对目的蛋白进行纯化，并进行SDS-PAGE检测，结果发现，纯化获得的蛋白条带清晰、单一，纯度较高，大小约35 kD，与预期结果一致，说明已成功诱导表达获得融合蛋白KRE9，纯化效果较好。

2. 3 Western blotting鉴定结果

利用抗His-tag抗体对纯化后的融合蛋白KRE9进行Western blotting检测分析，结果显示在35 kD处出现特异性反应条带（图5），说明融合蛋白KRE9能与抗His-tag抗体发生特异性结合，该特异条带为His标签融合蛋白KRE9。

2. 4 融合蛋白KRE9比活性测定结果

以葡萄糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图6所示。线性回归方程为y=0.0011x-0.0229，相关系数R?=0.994，说明相关性较好，可作为标准曲线。

融合蛋白KRE9比活力测定结果如图7所示。在葡萄糖溶液中加入融合蛋白KRE9后，0～40 s酶促反应速度较快，葡萄糖含量明显减少，40 s后进入反应平缓期，60 s时反应结束。结合葡萄糖标准曲线，通过比活力计算公式得出KRE9比活力为9.169×104 U/mg，表明诱导表达获得的融合蛋白KRE9有较高的酶活性。

3 讨论

本研究利用PCR扩增获得KRE9基因，并构建其原核表达载体pET28a-KRE9，转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）后，通过IPTG诱导表达及His标签纯化树脂纯化成功获得融合蛋白KRE9，但SDS-PAGE检测结果显示其多数以包涵体存在，少数为可溶性蛋白。为了实现融合蛋白KRE9可溶性表达，本研究预先优化了诱导温度、时间及IPTG浓度，虽然对其表达形式有明显改善，但仍未获得大量可溶性蛋白，可能是在优化条件下部分表达宿主不表达或表达过低导致表达目的蛋白总量减少，与关波（2014）、王靖瑶等（2014）研究结论相似，也可能是KRE9参与了细胞壁的合成，影响表达宿主的生理代谢活动，从而导致其表达量减少。

据文献报道，传统测定KRE9活力的方法是以放射性的二磷酸尿苷（Uridine diphosphate，UDP）-[14C]葡萄糖为底物，通过检测UDP-[14C]葡萄糖放射活性的变化来确定酶活力（李鹏，2012）。而本研究中测定KRE9活力的方法无需使用含有放射性的葡萄糖，不仅安全性高，而且灵敏度强，操作简单快捷。另外，本研究根据KRE9蛋白合成β-葡聚糖的功能，参照王卫国（2012）的方法，检测到纯化的重组蛋白KRE9具有较高的酶活性。该方法与赵丽洋（2006）通过制备KRE9蛋白单克隆抗体检测KRE9蛋白活性的原理和操作完全不同。二者相比，本研究的方法具有操作简便、成本低廉、耗时少的特点。

4 结论

采用原核表达成功获得高纯度的重组蛋白KRE9，纯化的KRE9蛋白具有良好的生物学活性，可促进葡萄糖合成β-葡聚糖，为进一步研究其在热带念珠菌生长过程中所发挥作用提供参考。

参考文献：

顾春银，张震宇. 2014. 利用蛋白标签纯化酿酒酵母RAVE-V1复合物[J]. 生物加工过程，12（5）：34-38. [Gu C Y，Zhang Z Y. 2014. Purification of RAVE-V1 complex from Sa-ccharomyces cerevisiae via protein tagging[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering，12（5）：34-38.]

关波. 2014. 改良人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究[D]. 无锡：江南大学. [Guan B. 2014. Improvement of secretory expression of human serum albumin fusion protein in Pichia pastoris[D]. Wuxi：Jiangnan University.]

李鹏. 2012. 灰树花β-葡聚糖合成酶的提取、纯化及其酶学性质研究[D]. 郑州：河南工业大学. [Li P. 2012. Extraction， purification and characterization of Grifola frondosa β-glucan synthase[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

陆志方. 2016. 固相合成抗菌肽CGA-N46及其衍生物生物信息学分析和生物活性研究[D]. 郑州：河南工业大学. [Lu Z F. 2016. Study of solid phase synthesis of antifungal peptide CGA-N46 and its derivatives of bioinforma-tics analysis and biological activity[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

汪家政，范明. 2001. 蛋白技术手册[M]. 北京：科学技术出版社. [Wang J Z，Fan M. 2001. Handbook of Protein Technology[M]. Beijing：Science and Technology Press.]

王靖瑤，王天女，卢磊，张帅，赵敏. 2014. 大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略[J]. 中国生物工程杂志，34（6）：98-104. [Wang J Y，Wang T N，Lu L，Zhang S，Zhao M. 2014. Research advances in secretary production of recombinant protein using Escherichia coli type I secretion systen and strategies for enhancement of secretion of type I pathway[J]. Journal of Chinese Biotechnology，34（6）：98-104.]

王衛国. 2012. 一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法：102443621B[P]. 2012-05-09. [Wang W G. 2012. Method for detecting activity of β-glucan synthase：102443621B[P]. 2012-05-09.]

魏春红. 2012. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京：高等教育出版社. [Wei C H. 2012. Experiment Technology for Modern Molecular Biology[M]. Beijing：Higher Education Press.]

薛雯雯. 2010. CGA-N46基因在枯草芽孢杆菌中的多顺反子表达及表达条件优化[D]. 郑州：河南工业大学. [Xue W W. 2010. Polycistronic expression of CGA-N46 gene in Bacillus subtilis and its fermentation optimization[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

薛正莲， 张珂. 2013. 表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化[J]. 中国生物制品学杂志，26（1）：100-104. [Xue Z L，Zhang K. 2013. Optimization of fermentation condition of recombinant E. coli for expression of glutamate decarboxylase[J]. Chinese Journal of Biologicals，26（1）：100-104.]

赵丽洋. 2006. 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶抑制剂筛选模型的建立及研究 白色念珠菌β-1，3-葡聚糖合成酶调节亚基CaRho的克隆表达[D]. 北京：中国协和医科大学. [Zhao L P. 2006. Establishment and study of a screening model for β-1，3-glucan synthetase inhibitors of Candida albicans Cloning and expression of the regulatory subunit CaRho of Candida albicans β-1，3-glucan synthase[D]. Beijing：Peking Union Medical College.]

翟中会，陈希南，王娟. 2008. 利用Primer Premier 5.0进行引物设计[J]. 西北医学教育，16（4）：695-698. [Zhai Z H，Chen X N，Wang J. 2008. Primer design with primer premier 5.0[J]. Northwestern Medical Education，16（4）：695-698.]

张萍，赵强，魏东盛，杨娇，朱项阳，朱旭东. 2016. 酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通过调节细胞壁合成相关基因的表达影响细胞壁完整性[J]. 微生物学报，56（7）：1132-1140. [Zhang P，Zhao Q，Wei D S，Yang J，Zhu X Y，Zhu X D. 2016. Snf1/AMPK affects cell wall integrity through regulating the transcription of cell wall as sembly-related genes in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbiology China，56（7）：1132-1140.]

周小玲，沈微，饶志明，王正祥，诸葛健. 2004. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报，31（4）：89-92. [Zhou X L，Shen W，Rao Z M，Wang Z X，Zhuge J. 2004. A rapid method for preparation of fungal chromosome DNA[J]. Microbiology China，31（4）：89-92.]

Amprayn K，Rose M T，Kecskés M，Pereg L，Nguyen H T，Kennedy I R. 2012. Plant growth promoting characteristics of soil yeast（Candida tropicalis HY） and its effectiveness for promoting rice growth[J]. Applied Soil Eco-logy，61（5）：295-299.

Douglas C M，Marrinan J A，Li W，Kurtz M B. 1994. A Saccharomyces cerevisiae mutant with echinocandin-resistant 1，3-beta-D-glucan synthase[J]. Journal of Bacteriology，176（18）：5686-5696.

Gomaa A M，Moawad S S，Ebadah I M A，Salim H A. 2005. Application of bio-organic farming and its influence on certain pests infestion，growth and productivity of potato plants[J]. Research Journal of Applied Sciences，1（2）：2005-2211.

He Z，Luo L，Keyhani N O，Yu X，Ying S，Zhang Y. 2017. The C-terminal MIR-containing region in the Pmt1 O-mannosyltransferase restrains sporulation and is dispen-sable for virulence in Beauveria bassiana[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，101（3）：1143-1161.

Lesage G，Bussey H. 2006. Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，70（2）：317-343.

Lussier M，Sdicu A M，Shahinian S，Bussey H. 1998. The Candida albicans KRE9 gene is required for cell wall β-1，6-glucan synthesis and is essential for growth on glucose[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，95（17）：9825-9830.

Mata D C. 2013. Producción de la proteína recombinante Kre9 del hongo patógeno Candida albicans con actividad proinflamatoria y protumoral[D]. Spain：Universidad del País Vasco.

Mekki B B，Ahmed A G. 2005. Growth，yield and seed quality of soybean（Glycine max L） as affected by organic，biofertilizer and yeast application[J]. Research Journal of Agriculture & Biological Sciences，1（4）：320-324.

Mostert T T，Divol B. 2014. Investigating the proteins released by yeasts in synthetic wine fermentations[J]. International Journal of Food Microbiology，171（5）：108-118.

Pan H P，Wang N，Tachikawa H，Nakanishi H，Gao X D. 2017. β-1，6-glucan synthesis-associated genes are required for proper spore wall formation in Saccharomyces cerevisiae： Yeast spore wall and β-1，6-glucan[J]. Yeast，doi： 10.1002/yea.3244.

Patle S，Lal B. 2007. Ethanol production from hydrolysed agricultural wastes using mixed culture of Zymomonas mobilis and candida tropicalis[J]. Biotechnology Letters，29（12）：1839-1843.

Puppala K R，Naik T，Shaik A，Dastager S，Ravi K V，Khire J，Dharne M. 2018. Evaluation of Candida tropicalis（NCIM 3321） extracellular phytase having plant growth promo-ting potential and process development[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，13：225-235.

Radi? D S，Pavlovi? V P，Lazovi? M M，Jovi?i?-Petrovi? J P，Karli?i? V M，Lalevi? B T，Rai?evi? V B. 2017. Copper-tolerant yeasts：Raman spectroscopy in determination of bioaccumulation mechanism[J]. Environmental Science & Pollution Research，24（27）：21885-21893.

Weber L. 2014. Characterization of Schizosachharomyces po-

mbe Sup11p， a protein involved in beta-1，6-glucan bio

synthesis[D]. Heidelberg：Ruperto-Carola University of

Heidelberg.

（責任编辑 陈 燕）