棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

张书芹

摘要：【目的】研究激素與棉花蕾铃脱落的关系，为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料。【方法】以50 mg/L赤霉素（GA3）和250 mg/L乙烯利（CEPA）分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester，H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver，利用抑制消减杂交（SSH）技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库，反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列，然后进行基因功能注释与功能分类，并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律。【结果】以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，所构建的cDNA文库命名为GA文库；以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，所构建的cDNA文库命名为CE文库。从构建的两个消减文库（GA和CE）中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列，通过基因功能注释与功能分类，可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类，其中与翻译相关的EST序列占24.14%，说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成。从消减文库中挑选10个差异表达基因（EST序列）进行RT-PCR分析，结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化。【结论】棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达，进而影响器官脱落，是其对逆境胁迫反应的结果。

关键词： 棉花蕾铃；赤霉素；乙烯；离层；cDNA文库；抑制消减杂交（SSH）

中图分类号： S562 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-0832-07

Abstract：【Objective】The present study investigated the relationship between hormones and abscission of cotton boll to provide basic data on gene expression， regulation and function of abscission related genes. 【Method】The cDNA of boll abscission layers treated by 50 mg/L gibberellin solution（GA3） and 250 mg/L ethephon solution（CEPA） respectively was used as Tester， while cDNA prepared from abscission layers which were treated with H2O was used as Driver. Subtractive library treated with GA3 and CEPA was constructed by suppression subtractive hybridization（SSH） technology and the EST sequence differentially expressed in abscission layer was selected by reverse Northern blotting. Then gene function annotation and function classification were carried out. The tissue expression patterns and GA3 induced expression patterns of the differentially expressed genes in boll abscission layer were analyzed. 【Result】The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with GA3， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library. The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with CEPA， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library.Twenty-nine EST sequences differentially expressed in abscission layer were found in the two constructed subtractive libraries（GA and CE） by sequence analyzed. Through gene function annotation and function classification， the EST sequences were involved in translation， metabolism， signal transduction， transcription， protein synthesis， energy metabolism， stress defense， genome DNA and unknown function. The genes that related to translation accounted for 24.14%， which showed that there was a great deal of protein synthesis after hormonal treatment in abscission layer cells. Ten diffe-rentially expressed genes（EST sequence） from these libraries were analyzed by RT-PCR. It was found that the expression patterns of some genes changed after the cotton boll abscission layer was treated with GA3. 【Conclusion】After hormone treatment， the abscission layer of cotton boll can activate the expression of abscission-related genes， thus affecting the abscission of organs， which is the result of their response to adversity stress.

Key words： cotton boll； gibberellin； ethylene； abscission layer； cDNA library； suppression subtractive hybridization（SSH）

0 引言

【研究意义】棉花（Gossypium）是世界上最重要的经济作物之一，棉纤维是纺织工业自然纤维的主要来源。在实际生产中，棉花蕾铃脱落是非常普遍的现象，其脱落高峰在棉株盛花期后5～10 d，脱落率在60%～70%，高的可达80%。不同棉种其蕾铃脱落率也不同，一般表现为陆地棉脱落率高于海岛棉（张炎等，2012；邓忠等，2017）。影响棉花蕾铃脱落的因素较多，除了生理脱落因素外，生育期的灌溉与施肥策略也发挥着重要作用，因此，解析棉花蕾铃脱落机制对提高棉花单位面积产量具有重要意义。【前人研究进展】乙烯在植物器官脱落过程中起促进作用（Tranbarger et al.，2017），如苹果幼果脱落与乙烯含量上升密切相关（Yuan，2007；Zhu et al.，2011），而外源施用乙烯或乙烯利可促进植物器官脱落，采用乙烯处理玫瑰后其花瓣脱落率显著升高（Singh et al.，2011），处理橄榄后其成熟果实脱落也显著增加（Gil-Amado and Gomez-Jimenez，2012），采用2 mL/L乙烯利喷施龙眼果穗10 d内可造成62.46%的果实脱落（杨子琴等，2015），喷施1.80 g/L乙烯利2和4周后澳洲坚果的落果率分别达98.75%和100.00%（柳觐等，2017）。尽管现有的研究已表明乙烯浓度上升与植物器官脱落呈正相关，但乙烯浓度上升只是器官脱落的中间环节；因为只有促使乙烯合成才会引起离层细胞壁水解酶活性增强及相关基因表达量上升，离层细胞壁破碎，最终导致器官脱落（Roberts et al.，2002）。赤霉素（GA3）对植物器官脱落也有一定的调控作用。Bains等（1999）在芒果中研究发现，内源GA3含量不论是在脱落的果实还是果蒂中，均低于未脱落的果实和果蒂；Gómez-Cadenas等（2000）研究发现，脱落柑橘果实中的活性GA3含量较未脱落时约降低400%；孙颖等（2014）研究表明，喷施不同浓度的外源GA3均能抑制油桐花芽分化，其中以喷施200 mg/L的抑制效果最明显；杨波等（2015）研究表明，新梢和幼果中对应内源激素间的浓度平衡关系是调控扁桃幼果生理脱落的重要因素，表现为幼果中高GA3和生长素（IAA）浓度、低脱落酸（ABA）浓度有利于扁桃坐果；李长江等（2017）研究发现，库尔勒香梨萼片脱落与内源激素的分布密切相关，其中幼果萼端GA3的积累可能有利于果实萼片脱落。【本研究切入点】目前，已有学者从离层相关基因方面研究揭示植物器官脱落的原理。Cho等（2008）研究發现，IDA、HSL2、HAE和MAPK激酶调控花器官离层的形成；Leslie等（2010）、Lewis等（2010）、Niederhuth等（2013）研究认为，类受体细胞质激酶负调控IDA/HAE信号蛋白，进而影响离层发育；常璟等（2015）从陆地棉中克隆获得调控离层分化及形成相关的BOP基因；但至今鲜见针对棉花蕾铃脱落的分子机制研究。【拟解决的关键问题】以50 mg/L GA3和250 mg/L乙烯利分别处理的离层cDNA为Tester，H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver，利用抑制消减杂交（Suppression subtraction hybridization，SSH）技术构建经GA3和乙烯处理后的cDNA文库，对获得的离层差异表达EST序列进行基因功能注释与功能分类，并分析离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律，为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为华中农业大学棉花试验田种植的陆地棉（G. hirsutum）遗传标准系TM-1，于棉蕾开花当天分别用50 mg/L GA3、250 mg/L乙烯利（CEPA）和H2O（CK）点涂其离层，并于点涂后0、1、2、4、8、12、24、48和72 h及5 d以刀片切取约0.5 cm的离层组织，经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1. 2 核酸提取及mRNA分离

采用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA（Li et al.，2002），用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计法测定其浓度和纯度。取GA3、CEPA和H2O处理各时期的RNA分别等量混合，按照Oligotex mRNA Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN公司）说明，从总RNA中分离纯化出mRNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 3 抑制消减文库构建

以50 mg/L GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，构建cDNA文库GA；以250 mg/L CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，构建cDNA文库CE。采用Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtractive Kit试剂盒（美国BD公司）完成抑制消减杂交，对消减后的第二次PCR产物进行纯化、连接并转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选，即获得消减文库。

1. 4 消减文库鉴定及序列分析

挑取阳性克隆接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，取菌液进行PCR鉴定。然后挑选插入片段大于250 bp、带型单一的PCR产物点制Microarray。将GA3、CEPA和H2O处理各时期的RNA等量混合，采用MLV Reverse Transcriptase（美国Promega公司）进行反转录，以1.00 μL的10 m Ci/mL[α-32P]-dCTP进行探针标记，经杂交、洗膜和磷屏成像，通过Array Gauge Version 1.0对信号值进行数字化转换。选取杂交信号值变化明显的克隆进行接菌培养及测序分析，测序结果去除载体和接头序列，利用GenBank数据库中的BLASTx分析对所获得的EST序列进行功能分类。

1. 5 RT-PCR分析差异基因表达情况

对两个消减文库中差异表达的EST序列设计特异引物，以陆地棉TM-1的根、茎和叶及经GA3处理0.5、2.0、4.0、8.0和12.0 h的蕾铃离层，共8个材料的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系20.00 ?L：10×Buffer 2.00 ?L、MgCl2（25 mmol/L）1.50 ?L、正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 ?L、dNTP（10 mmol/L）0.40 ?L、稀释后的反转录产物1.00 ?L、Taq DNA酶1 U、ddH2O补足至20.00 ?L。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。取8.00 ?L PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

2 结果与分析

2. 1 总RNA和mRNA质量检测结果

GA3、CEPA和H2O处理各时期总RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，发现28S、18S和5S条带清晰，无明显拖尾，且18S和28S两条条带明亮（图1），说明总RNA完整性良好。所有样品的OD260/OD280均在1.8以上，浓度超过1 ?g/?L，说明RNA纯度高，符合建库要求。采用Oligotex法分离mRNA，然后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示3个材料的mRNA均无明显28S和18S条带，呈弥散状（图2），说明rRNA已剔除，mRNA完整性良好。

2. 2 抑制消减文库构建情况

以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，构建的文库命名为GA文库；以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver，构建的cDNA文库命名为CE文库。经第二轮PCR扩增后，凝胶电泳检测显示两个文库消减后的产物均呈弥散状分布，无明显主带，分子量大小为250～1000 bp，平均在500 bp左右（图3），符合对文库装载片段大小的要求。

2. 3 消减文库的PCR鉴定及反向Northern blotting筛选结果

第二轮PCR产物经连接和转化后，挑选长势较好的白色菌落使用SP6和T7通用引物进行菌液PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，插入片段分子量范围在200～1000 bp，平均在500 bp左右。说明插入片段呈随机分布，扩增效率好。部分克隆的PCR扩增电泳结果见图4，反向Northern blotting筛选结果见图5。

2. 4 EST同源性分析结果

从GA文库中选取杂交信号比值大于3或小于1/3的克隆97个，从CE文库中选取杂交信号比值大于3或小于1/3的克隆11个进行测序分析，去除重复序列和低质量序列后，从GA文库中共获得68条高质量的EST序列，从CE文库中共获得11条高质量的EST序列。对获得的EST序列先以TBLASTx进行注释比较，然后用ClustalX对同一基因的不同片段合并后，文库GA有25条EST序列，文庫CE有4条EST序列，共产生29条EST序列。这29条EST序列中来自拟南芥的有11条，来自棉花的有6条，其余的来自其他物种。

为进一步了解这些EST序列的功能，参照Bevan等（1998）、Mahalingam等（2003）的方法对其功能进行分类，结果发现筛选出的29条EST序列可分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能九大类（表1）。其中，与翻译相关的EST序列占24.14%，与信号传导、代谢相关和转录相关的EST序列各占13.79%，与能量代谢相关的EST序列占10.35%，与蛋白合成、抗逆相关和基因组序列相关的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。

2. 5 RT-PCR分析结果

从消减文库中挑选10个差异表达基因（EST序列）进行RT-PCR，分析其在陆地棉TM-1根、茎、叶及经GA3处理蕾铃离层中的诱导表达模式。结果（图6）表明，查耳酮合酶（Chalcone synthase）基因在根、茎、叶中均有表达，GA3诱导2.0 h后其在蕾铃离层中的表达量最高。脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase）基因在各组织均有表达，但在蕾铃离层中的表达量明显高于其他组织。肽基脯氨酰基顺反异构酶（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）基因在根和茎中表达量很高，在叶和GA3诱导蕾铃离层中表达较弱，经GA3诱导2.0 h后几乎不表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因在各组织均有表达，GA3诱导2.0和8.0 h后的表达量最高。纤维蛋白（Fiber protein）基因在根和叶中表达很弱，在茎和蕾铃离层中的表达强度一般。翻译调节肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein）基因在根和茎中表达量非常高，在叶中几乎不表达，GA3诱导0.5 h后在蕾铃离层中微弱表达，诱导12.0 h后表达量达最高值。GA-2-A23在根、茎、叶和蕾铃离层中表达量均较高；CE-1-K17需在GA3诱导4.0～12.0 h后才表达，以诱导4.0 h的表达量最高，然后逐渐下降；GA-1-L22在根、茎和叶中均不表达，经GA3诱导后呈微弱的表达；GA-2-N8在茎和叶中均不表达，在根和GA3诱导蕾铃离层中的表达量也较低。可见，以GA3处理蕾铃离层后部分基因的表达模式会发生变化。

3 讨论

SSH技术是以两轮消减杂交和两次PCR扩增为核心，致使差异表达的基因片段大量富集，具有假阳性低、灵敏度高、筛选效率高、操作简单、周期短等优点（周变华等，2011；蒋小珍等，2014；樊莹和董霞，2015）。目前，利用SSH技术已分离获得棉花体细胞胚发生过程中的相关基因（Zeng et al.，2006）、原生质体培养棉花细胞壁再生相关基因（Yang et al.，2008）及棉花受黄萎病菌诱导表达的差异基因（Xu et al.，2011）等。本研究采用SSH技术构建棉花蕾铃离层经GA3、乙烯处理后的cDNA文库，并从构建的两个消减文库（GA和CE）中筛选出29个在离层差异表达的EST序列，通过基因功能注释与功能分类，可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类。其中，与翻译相关的EST序列占24.14%，与信号传导、代谢相关和转录相关的EST序列各占13.79%，与能量代谢相关的EST序列占10.35%，与蛋白合成、抗逆相关和基因组序列相关的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。该结论为进一步研究棉花蕾铃脱落机制提供了基础资料。

本研究采用GA3和乙烯利处理棉花蕾铃离层，构建了两个消减文库（GA和CE），测序分析和序列注释分析结果表明大部分基因是核糖体基因，可能是蛋白质大量翻译造成核糖体基因富集，也说明经激素处理后激活了大量基因的转录和翻译。其中，翻译调节肿瘤蛋白在物种间高度保守，并具有多种生物学功能。Lopez和Franco（2006）首次从草莓果实中克隆获得翻译调节肿瘤蛋白基因，且发现随着果实的成熟其表达量逐渐增加。陈科等（2012）研究表明，翻译调节肿瘤蛋白可调节细胞骨架的动态变化及细胞生长与增殖，能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录；调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应及保护细胞免受各种应激的损伤。本研究结果表明，翻译调节肿瘤蛋白基因在陆地棉的根、茎和经GA3诱导蕾铃离层中呈上调表达，且在GA3诱导12.0 h后表达量达峰值。肽基脯氨酰基顺反异构酶基因与植物响应逆境有关（Romano et al.，2004）。本研究从GA3处理的GA文库中也克隆出该基因，但在叶和GA3诱导蕾铃离层中表达较弱，尤其是经GA3诱导2.0 h后几乎不表达，说明其表达与GA3诱导处理有关。查耳酮合酶是类黄酮类物质生物合成途径中的关键酶，是广泛存在于高等植物中的次生代谢物，在植物花色素形成及抗虫、抗病方面发挥重要作用（杨继和顾红雅，2006）。在本研究中，查耳酮合酶基因在根、茎、叶中均有表达，经GA3诱导2.0 h后其在蕾铃离层中的表达量最高。可见，棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达，进而影响器官脱落，是其对逆境胁迫反应的结果。

4 结论

棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达，进而影响器官脱落，是其对逆境胁迫反应的结果。该结论为进一步研究棉花蕾铃脱落机制提供了基础资料。

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（責任编辑 兰宗宝）