拮抗甜瓜枯萎病链霉菌D2菌株发酵条件的优化

邹立飞 余小兰 邹雨坤 李光义 李晓亮 郑鹏 李勤奋

摘要：【目的】優化甜瓜枯萎病拮抗链霉菌D2菌株的发酵条件，为该菌发酵方法的建立及工业化生产提供科学依据。【方法】以D2菌株有效活菌数为考察指标，玉米粉含量、豆饼粉含量、pH、摇床转速、接种量和温度为影响因素，利用响应面法对D2菌株的发酵条件进行优化。【结果】豆饼粉含量、玉米粉含量和温度对D2菌株有效活菌数有显著影响（P<0.05）。D2菌株有效活菌数回归模型为：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32（式中，Y为有效活菌数对数，X1、X2和X3分别为玉米粉含量、豆饼粉含量和温度的编码值），理论有效活菌数为2.99×108 CFU/mL。D2菌株最优发酵条件为：玉米粉含量39.08 g/L、豆饼粉含量39.19 g/L、培养温度37.4 ℃，在此条件下D2菌株有效活菌数为3.01×108 CFU/mL，与理论值接近，但极显著高于未经优化采用培养基Ⅱ得到的有效活菌数（1.0×106 CFU/mL）（P<0.01）。【结论】采用响应面法优化得到的D2菌株发酵条件可有效提高该菌株有效活菌数，且回归模型推算出的理论活菌数与优化条件发酵的有效活菌数接近，可用于指导D2菌株的实际规模化生产。

关键词： 甜瓜枯萎病；拮抗菌；链霉菌；响应面法；发酵条件

中图分类号： S436.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-0905-07

Abstract：【Objective】The present study aimed to explore an optimal fermentation condition of streptomyces strain D2 that was against muskmelon fusarium wilt so as to provide scientific basis for the establishment of the strain fermentation method and industrial production. 【Method】The viable bacteria number of strain D2 was taken as the indicator of the investigation， and influencing factors included corn powder content， soybean powder content， pH， rotation speed， inoculation amount and temperature. The fermentation condition of strain D2 was optimized by employing the combination of Plackett-Burman（P-B） design， uphill path method， central composite design（CCD） and response surface method. 【Result】The results showed that corn powder content， soybean powder content and temperature significantly affected viable bacteria number of strain D2（P<0.05）. The regression model of viable bacteria number of strain D2 was：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32 ， and the viable bacteria number was 2.99×108 CFU/mL in theory. The optimal fermentation conditions for strain D2 was： corn powder content 39.08 g/L， soybean powder content 39.19 g/L and culture temperature 37.4 ℃. Under these conditions， the viable bacteria number of strain D2 was 3.01×108 CFU/mL， which was close to the theoretical content，but was extremely significant higher than the viable bacteria number（1.0×106 CFU/mL） obtained by using mediumⅡwithout optimization（P<0.01）. 【Conclusion】The optimum fermentation culture technique for strain D2 optimized by response surface method can effectively improve the viable bacteria number. The viable bacteria number predicted by regression model is close to the actual number fermented under the optimized fermentation condition. Therefore， this model can be used to predict the fermentation of D2 strains in practical production.

Key words：muskmelon fusarium wilt； antagonistic bacteria； streptomyces； response surface method； fermentation condition

0 引言

【研究意义】甜瓜枯萎病是主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的一种土传病害（南宇航等，2016），可危及甜瓜整个生育期，以开花到结果期发病最严重，常造成大片瓜田绝收甚至植株死亡（黄美莲，2006）。如何有效预防并控制甜瓜枯萎病害发生，是当前甜瓜种植产业的重要任务之一。目前，甜瓜枯萎病的防治主要使用硫酸铜（牛梦天，2016）、高锰酸钾（Xu et al.，2012；马振玲，2016）、恶霉灵（杨长成等，2010）和枯萎宁（周小林等，2007）等化学药剂，但这些化学药剂无法从根本上杀灭病菌，且农药残留会影响甜瓜果实的质量安全（?zbah?e et al.，2014）。生物防治因防治效果较好且具有环保、无药害等特点，开发应用潜力巨大。链霉菌是一类重要的生防菌资源，可直接或间接产生抑菌物质，从而达到防控枯萎病的效果。因此，优化链霉菌株发酵工艺参数，对链霉菌制剂的规模化生产及甜瓜枯萎病害的有效防控具有重要意义。【前人研究进展】前人已从不同环境筛选出多株对植物枯萎病菌具有拮抗作用的链霉菌菌株。Li等（2012）从土壤中筛选到一株拮抗链霉菌（Streptomyces sp.），将该菌制成发酵液后应用于黄瓜枯萎病防治上效果显著；甘良等（2015）分离筛选获得两株链霉菌菌株153和SF6，并证实二者对茄子和番茄枯萎病的防治效果分别达83.72%和69.85%；闫建芳等（2016）将筛选到的生防链霉菌应用于黄瓜上，发现其对枯萎病的相对防效在65%以上。因此，将链霉菌应用于枯萎病的生物防治具有较大的研究及应用价值（孙建龙等，2012）。目前，优化拮抗菌培养条件是提高其抑菌能力、增加产量的一条重要途径（Lara et al.， 2006；Desai et al.，2008），而响应面法因结合数学和统计学方法，能全面考虑各因素间交互作用，且具有工作量小、时间短、优化效果好等特点，已成功应用于微生物功能菌的培养基优化（Lu et al.， 2009）。孙沙沙等（2013）采用单因素试验与响应面法相结合的方法对烟草野火病拮抗菌的发酵条件进行优化，其拮抗效果提高25.72%。张艳敏等（2016）采用响应面法对褐黄孢链霉菌ZM701发酵培养基进行优化，其纳他霉素产量可提高77.8%。【本研究切入点】目前，国内外对甜瓜枯萎病的生物防治报道中多数是利用细菌和真菌进行防治，而采用放线菌防治的报道较少。此外，相对于正交试验和单因素试验法，响应面法具有工作量小、精确度高等特点，更适合于微生物功能菌发酵工艺的优化。【拟解决的关键问题】D2菌株是本研究团队从海南露地栽培厚皮甜瓜根际土壤中筛选获得的一株利迪链霉菌，经盆栽防效试验证实该菌株对甜瓜枯萎病的防治效果达73.53%（邹立飞，2013）。本研究以D2菌株有效活菌数为考察指标，玉米粉含量、豆饼粉含量、pH、摇床转速、接种量和温度为影响因素，利用Design Expert 7.0响应面法对D2菌株进行发酵条件优化设计，以期为该菌发酵方法的建立及工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌株 供试利迪链霉菌D2菌株为本研究团队从海南露地栽培厚皮甜瓜的根际土壤中筛选获得。

1. 1. 2 培养基 培养基Ⅰ：可溶性淀粉20.00 g/L、KNO3 1.00 g/L、KH2PO3 0.50 g/L、NaCl 0.50 g/L、MgSO4 0.50 g/L、FeSO4 0.01 g/L、pH 7.2～7.4；培养基Ⅱ：玉米粉32.00 g/L、豆饼粉32.00 g/L、KH2PO3 0.50 g/L、NaCl 0.50 g/L、MgSO4 0.50 g/L、FeSO4 0.01 g/L、pH 7.2～7.4。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 种子液制备 将保存在-4 ℃条件下的D2菌株接种至培养基Ⅰ，置于38 ℃恒温培养箱中培养72 h，挑取单菌落接种至液体培养基Ⅰ中，再次置于38 ℃恒温培养箱中培养72 h，即得所需种子液。

1. 2. 2 发酵液制备 将1.2.1制备的种子液转入到培养基Ⅱ中，按试验设计的发酵条件进行培养，即得所需发酵液。另外，在发酵液培养72 h时，取样测定D2菌株的有效活菌数。

1. 2. 3 发酵条件优化设计

1. 2. 3. 1 P-B试验设计 采用Plackett-Burman（P-B）試验设计对影响D2菌株有效活菌数的7个因素进行研究，具体试验设计见表1，其中，水平-1为D2菌株常规培养条件，水平+1为水平-1的1.25倍；1个单位无机盐含量为0.50 g/L KH2PO3、0.50 g/L NaCl、0.50 g/L MgSO4、0.01 g/L FeSO4。

1. 2. 3. 2 最陡爬坡试验 根据P-B试验结果确定的影响D2菌株发酵的主要因子设计变化方向和步长，以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值确定变化步长，从而逼近最大响应区域，最终确定D2菌株有效活菌数最高的发酵条件（邹立飞，2013）。

1. 2. 3. 3 CCD设计 应用Design Expert 7.0，以最陡爬坡试验筛选的玉米粉含量、豆饼粉含量和温度为变量，对发酵试验进行CCD设计（表2）， 即可得到D2菌株发酵过程的二次方程模型。该模型可对变量的响应行为进行表征，并对3个发酵条件[玉米粉含量（x1）、豆饼粉含量（x2）、温度（x3）]进行响应面分析，从而得到D2菌株最优发酵条件。

1. 3 统计分析

采用Design Expert 7.0和SPSS 13.0对数据进行统计分析。

1. 4 回归模型验证

根据响应面法得到的最优发酵条件对D2菌株进行发酵培养。发酵完成后，取样测定D2菌株有效活菌数。通过测定其有效活菌数判定是否与回归模型推算出的理论活菌数一致。

2 结果与分析

2. 1 P-B试验结果分析

P-B试验设计及相关响应值见表3和表4。由表3和4可知，各因素对D2菌株有效活菌数的影响力表现为：豆饼粉含量>玉米粉含量>温度>无机盐含量>摇床转速>接菌量=初始pH，且豆饼粉含量、玉米粉含量和温度均达显著水平（P<0.05）。由此可确定影响D2菌株有效活菌数的主要因素是豆饼粉含量、玉米粉含量和温度。

2. 2 最陡爬坡试验结果分析

最陡爬坡试验设计及结果见表5。由表5可知，当玉米粉含量37.00 g/L、豆餅粉含量37.00 g/L、温度37.0 ℃时，D2菌株有效活菌数达最大值（1.94×108 CFU/mL），故以处理2作为CCD设计的中心点进行试验设计。

2. 3 CCD试验结果分析

CCD试验设计及相关结果见表6、表7、图1、图2和图3。由表6和表7可知，对玉米粉含量、豆饼粉含量和温度进行优化后，最终得到回归模型（响应方程）为：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32。当X1=1.04、X2=1.09、X3=0.21时，即Y最大，相对应的D2菌株理论有效活菌数为2.99×108 CFU/mL。由图1、图2和图3可知，当温度37.4 ℃、豆饼粉含量39.19 g/L、玉米粉含量39.08 g/L时，相应的由玉米粉和豆饼粉含量、玉米粉含量和温度、豆饼粉含量和温度分别构成的空间点在距离最优点较远处其上升速度大，距离近时上升速度小，故可确定玉米粉含量、豆饼粉含量和温度的最佳值分别为39.08 g/L、39.19 g/L和37.4 ℃。

2. 4 回归模型验证结果分析

为验证回归模型预测的准确性，用培养基Ⅱ及优化后培养基进行实际发酵培养试验，结果表明，当玉米粉含量39.08 g/L、豆饼粉含量39.19 g/L、温度37.4 ℃时得到的实际有效活菌数为3.01×108 CFU/mL，与回归模型推算出的理论活菌数（2.99×108 CFU/mL）接近，且极显著（P<0.01）高于未经优化采用培养基Ⅱ得到的有效活菌数（1.0×106 CFU/mL），故该模型可用于指导D2菌株的实际生产。

3 讨论

影响微生物发酵的因子主要有碳源、氮源、温度、接菌量、摇床转速、pH和无机盐含量等，其中碳源和氮源是微生物发酵的必需材料（赵能等，2016；王法国等，2017），但不同微生物在其生长过程中对碳和氮种类选择存在明显差异（宋瑛瑛等，2016；易子霆等，2016；杨冬静等，2017）。此外，温度（文凯，2016）、接菌量、摇床转速、pH（陈令等，2014）和无机盐含量等也会影响菌株发酵过程。本研究采用P-B试验设计对影响D2菌株发酵条件的7个因子进行分析，发现玉米粉（碳源）含量、豆饼粉（氮源）含量和温度是影响D2菌株发酵的主要因素，并对这3个主要因子进行优化，以获得D2菌株的最优发酵条件。不同链霉菌菌株采用该方法确定影响发酵的主要因子存在明显差异，如影响链霉菌菌株HD-010发酵的主要因素是葡萄糖、蔗糖（碳源）、玉米粉（氮源）和接种量（张海秀，2009），影响小链霉菌发酵的主要因素是温度、初始pH和装瓶量（孙建龙等，2012），而温度、接菌量、摇床转速和培养时间是影响链霉菌组合ST-2发酵的主要因素（闫建芳等，2016）。可见，影响发酵的主要因素是由菌种自身的遗传特征和生理特性决定，同时，微生物普遍具有一定的局域适应性，导致不同生境下获取的菌株具有其特有的最优发酵条件。因此，开展微生物发酵工作时必须充分认识不同菌株之间的特异性，有针对性地明确影响其发酵的主要因素，为优化目标菌株的发酵条件做准备。

目前，普遍采用响应面法对微生物发酵条件进行优化设计（Ambat and Ayyanna，2001），该方法集试验设计和数学建模为一体，通过建立预测模型，并对模型适应性、系数显著性及失拟项进行诊断和检验，可高效地确定多因子系统的最佳条件，从而达到优化微生物发酵工艺、提高生产效益的目的（Ratnam et al.， 2003；Trupkin et al.， 2003）。本研究采用该方法优化D2菌株发酵条件后，有效活菌数是基础培养基发酵的301倍，说明响应面法对链霉菌D2菌株有较好的优化效果。同时，利用该方法中的回归模型推算出的理论活菌数与优化发酵条件的实际有效活菌数基本一致，分别为3.01×108和2.99×108 CFU/mL。多个采用该方法优化链霉菌发酵条件的研究也发现理论活菌数与实际发酵活菌数高度一致（高先军，2010；燕照玲等，2014；李莉等，2015）。响应面法还广泛应用于多种杆菌的发酵条件研究，如优化马红球菌发酵培养基后显著提高了马红球菌胆固醇的降解率（蒋丹丹等，2008），并大幅提高大肠杆菌生产干扰素的能力（Hernández et al.， 2008）；芮广虎等（2012）采用Box-Behnken响应面法对FM4B菌株进行优化后，其抑菌圈面积扩大42%。

本研究仅对D2菌株发酵条件进行了优化，但对于发酵液的活性成分及抑菌机理尚不清楚，因此，后续研究有必要对发酵液的结构组成及抑菌机理进行重点分析，以期为甜瓜枯萎病生物防治的实践及推广提供科学依据。

4 结论

采用响应面法优化得到的D2菌株发酵条件可有效提高该菌株的有效活菌数，且回归模型推算出的理论活菌数与优化条件发酵的有效活菌数接近，可用于指导D2菌株的实际规模化生产。

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（责任编辑 麻小燕）