恩拉霉素对大鼠的慢性毒性试验

续文君 宋向东 黄鑫 梁剑平 张嘉男 高艳 程青芳 郝宝成

摘要：【目的】评估恩拉霉素对大鼠的慢性毒性作用，为其科学合理使用提供依据。【方法】选用240只SPF级Wistar大鼠为试验动物进行恩拉霉素的慢性毒性试验，根据其半数致死剂量（LD50）分别设高剂量组（1000 mg/kg）、中剂量组（200 mg/kg）、低剂量组（10 mg/kg）及空白对照组，按高、中、低剂量分别将恩拉霉素添加至大鼠饲料中加工成定制饲料，每天饲喂1次，连续饲喂6个月，通过临床观察、血液学分析、血清生化检测、脏器系数和病理学检查等评估恩拉霉素对大鼠的慢性毒性作用。【结果】在整个试验周期（6个月）内，各恩拉霉素剂量组的大鼠饮食饮水、大小便均正常，精神状况良好，被毛光泽，未出现死亡。与对照组相比，各恩拉霉素剂量组大鼠体重均无显著变化（P>0.05，下同）；随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素仅对大鼠中性粒细胞数有一定影响，对碱性磷酸酶、谷草转氨酶及白蛋白等血清生化指标有轻微影响。在脏器系数方面，连續给药6个月后，仅高剂量组大鼠肝脏和脾脏的脏器系数较对照组显著降低（P<0.05），其他的脏器系数均无显著变化。随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素对大鼠的肝脏、肺脏、肾脏和心脏等器官组织会产生轻微影响，主要表现为：高剂量组大鼠肝脏组织中央静脉周围的细胞呈轻微肿胀；肺脏组织有一定程度的淤血，肺间质轻微增宽；肾脏组织轻微充血，且肾小管上皮细胞轻微肿胀；心肌纤维轻度萎缩，心肌间质增宽。【结论】恩拉霉素的毒性极低，随着药物剂量的增加及给药时间的延长，其对大鼠的慢性毒性作用非常轻微，即恩拉霉素的临床用药安全性极高。

关键词： 大鼠；恩拉霉素；慢性毒性；脏器系数；组织病理变化

中图分类号： S859.796 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-1008-08

Abstract：【Objective】The study aimed to evaluate the chronic toxicity of enramycin on rats and provide scientific basis for its rational use. 【Method】A total of 240 SPF-grade Wistar rats were selected to test the chronic toxicity of enramycin. High-dose group（1000 mg/kg）， medium-dose group（200 mg/kg）， low-dose group（10 mg/kg） and blank control group were divided according to enramycin half lethal dose（LD50）. Enramycin was added to rat feedstuff in high， medium and low doses to be processed into customized feedstuff. The rats were fed once a day， continuously fed for six months. Then， the chronic toxicity of enramycin in rats was evaluated through clinical observations， hematology analysis， blood serum biochemical examination， organ coefficient and pathological examination. 【Result】During the entire test period （six months）， rats in every treatment group were normal in drinking and urination， and were in good spirits with glossy coat， no rat was dead. Compared with the control group， there was no significant change in the body weight of each enramycin dose group（P>0.05， the same below）. With the increase of drug dosage and prolongation of administration time， enramycin only had certain effects on the number of neutrophils in rats， and it slightly affected blood serum indexes of alkaline phosphatase， aspartate aminotransferase and albumin. In terms of organ coefficient， only six months after continuous medication， the organ coefficients of liver and spleen only in high-dose group rats was significantly lower than that of the control group（P<0.05）， and there was no significant change in other organ coefficients. With the increase of drug dose and prolongation of administration time， enramycin slightly affected the liver， lung， kidney and heart of rats. The main manifestations were： in high-dose group， the cells around its central vein of liver tissue were slightly swollen； lung tissue had certain degree of congestion， and the interstitial space was slightly widened； renal tissue was slightly congested， and renal tubular epithelial cells were slightly swollen； myocardial fibers were slightly atrophied， and myocardial interstitials were widened. 【Conclution】Enramycin has very low toxicity. With increase of drug dosage and prolongation of medication time， its chronic toxicity effects on rat is very slight， that is， the safety of enramycin in clinical medication is very high.

Key words： rat； enramycin； chronic toxicity； organ coefficient； histopathological change

0 引言

【研究意义】恩拉霉素（Enramycin）又称安来霉素、恩来霉素等，是由微生物发酵而来的一种多肽类抗生素，于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1993年日本武田药品工业株式会社向我国农业部申请登记注册该药（卜仕金，2003）。恩拉霉素具有较强的抑制革兰氏阳性菌作用，尤其对肠道有害菌的抑制力很强，且长期使用后不易产生耐药性，被世界上很多国家推荐作为动物促生长剂，是一种理想的饲料添加剂（陈洪等，2010；高艳江和张勇，2010；葉婷婷等，2011），但长期大量使用也会给生态环境造成一定影响。因此，有必要探究恩拉霉素是否具有潜在的迟发毒性作用，进一步评价其安全性。【前人研究进展】急性毒性试验已证实，恩拉霉素经口服、皮下或肌肉注射给药时实际无毒。其中，大鼠和小鼠口服恩拉霉素的半数致死剂量（LD50）均高于10.0 g/kg，而皮下或肌肉注射的LD50均高于5.0 g/kg；腹腔注射的LD50：小鼠750.0～830.0 mg/kg，大鼠830.0～910.0 mg/kg；静脉注射的LD50：小鼠30.0～31.2 mg/kg，大鼠66.0～77.0 mg/kg（卜仕金，2003）。张勇等（2010）通过肉鸡饲喂恩拉霉素试验，发现恩拉霉素对肉鸡小肠绒毛形态的影响极其明显，且对小肠形态有良好的改善作用。李勤等（2013）研究表明，恩拉霉素可显著提高断奶仔兔的生产性能，减少其腹泻发病率及降低死亡率。Martín等（2014）研究发现，于肉鸡饲料中添加恩拉霉素可有效促进肉鸡的生长。近年来，关于高产恩拉霉素菌株的研究较多，证实采用紫外诱变选育的恩拉霉素高产菌株产素水平稳定（王建玲等，2015）；离子注入诱变也是一种获得高产恩拉霉素变异菌株的有效方法（蔡作新等，2015；丁志雯等，2016）；而以20%油酸乙酯、40%聚氧乙烯氢化蓖麻油和40%丙二醇组成的恩拉霉素自微乳制剂质量稳定，有望改善其生物利用度（陈浩等，2016）。此外，针对恩拉霉素的生物检测方法得到有效改进，其中以干燥滤纸片法的操作最简单快捷，可实现大批量样品同时检测，具有极高的实用价值（许铭玉等，2017）。【本研究切入点】至今，有关恩拉霉素对大鼠慢性毒性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】将不同剂量的恩拉霉素添加至大鼠饲料中，连续饲喂6个月，通过临床观察、血液学分析、血清生化检测、脏器系数和病理学检查等评估恩拉霉素对大鼠的慢性毒性作用，为该药科学合理使用提供依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

恩拉霉素原料药（恩拉霉素含量11.58%）由石家庄高科动物保健品有限公司生产提供，生产批号2016-098。SPF级Wistar大鼠240只，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，体重50.0～70.0 g/只，雌（♀）雄（♂）各半，临床检查为健康大鼠。试验大鼠购入后在实验室条件下暂养观察7 d，自由采食饮水。

1. 2 试验分组与给药

按《中国兽药典》的相关规定要求，将240只大鼠随机分成4组，每组60只，雌雄各半。设恩拉霉素LD50的1/10为高剂量组（1000 mg/kg）、1/50为中剂量组（200 mg/kg）、1/1000为低剂量组（10 mg/kg），并设未添加恩拉霉素的空白对照组。根据试验设计，试验前将其按高、中、低剂量分别添加至大鼠饲料中加工成定制饲料，每天饲喂1次，连续给药6个月。试验期间各处理组大鼠均自由饮水，自由采食（郑筱萸，2002；费陈忠等，2013）。

1. 3 指标观察

1. 3. 1 临床症状与体质量检查 每天观察试验大鼠的饮食、精神状态及行为活动，并记录异常情况，每月对大鼠称重1次，直至试验结束。

1. 3. 2 血液学分析及血清生化学指标测定 于给药3和6个月后分别对试验大鼠进行心脏采血，借助相关仪器进行血液学分析和血清生化指标测定，检验项目包括红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）和血红蛋白含量（HGB）等常规指标及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、尿氮素（BUN）和肌酐（CREA）等生化指标。

1. 3. 3 主要脏器系数与组织病理学观察 经心脏采血后的试验大鼠立即处死，取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏称重，计算相对脏器系数。称重后取各器官组织固定于10%甲醛溶液中，经石蜡包埋、切片和HE染色，镜检观察各器官组织的病理变化并拍照记录。

1. 4 统计分析

采用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析，其中大鼠增重、血常规血生化指标和脏器系数均进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2. 1 恩拉霉素对大鼠临床症状及体质量的影响

在整个试验周期（6个月）内，各恩拉霉素剂量组的大鼠饮食饮水、大小便均正常，精神状态良好，被毛光泽，未出现死亡。与对照组相比，各恩拉霉素剂量组大鼠体质量均无显著变化（P>0.05，下同）（表1），即长期服用恩拉霉素对大鼠体质量无明显影响。

2. 2 恩拉霉素对大鼠血液生理指标的影响

与对照组相比，连续给药3个月后，中、低剂量组大鼠的各项血液常规生理指标均无显著变化，仅高剂量组雌性大鼠的中性粒细胞显著下降（P<0.05，下同）；连续给药6个月后，高、中剂量组雌性大鼠的中性粒细胞显著升高，但白细胞、淋巴细胞比率和红细胞等其他检测项目无显著变化（表2）。说明随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素仅对大鼠中性粒细胞有一定影响。

2. 3 恩拉霉素对大鼠血清生化指标的影响

与对照组相比，连续给药3个月后，中、低剂量组大鼠的各项血液生化指标均无显著变化，仅高剂量组雌性大鼠的碱性磷酸酶活性显著升高；连续给药6个月后，高剂量组大鼠的谷草转氨酶活性显著下降，高、中剂量组雌性大鼠的白蛋白含量显著升高，其他检测项目变化差异均不显著（表3）。说明随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素对大鼠碱性磷酸酶、谷草转氨酶及白蛋白等血清生化指标有轻微影响。

2. 4 恩拉霉素对大鼠脏器系数的影响

与对照组相比，连续给药3个月后，除高剂量组雌性大鼠肝脏和脾脏、雄性大鼠肺脏的脏器系数有显著变化外，其他的脏器系数均无显著变化，中、低剂量组各器官组织的脏器系数也均无显著变化；连续给药6个月后，仅高剂量组雄性大鼠肝脏和脾脏的脏器系数较对照组显著降低，其他的脏器系數均无显著变化（表4）。说明恩拉霉素的毒性很低，但随着药物剂量的增加及给药时间的延长，其对大鼠肝脏、脾脏和肺脏会产生轻微影响。

2. 5 恩拉霉素对大鼠器官组织病理变化的影响

经显微镜镜检发现，对照组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器的组织结构均正常。相对于对照组，恩拉霉素中、低剂量组大鼠的肝脏和肺脏组织未见异常，高剂量组大鼠的肝脏组织也基本正常，仅中央静脉周围的细胞呈轻微肿胀（图1）；高剂量组大鼠肺脏组织有一定程度的淤血，肺间质轻微增宽（图2）；中剂量组大鼠的肾脏组织轻微充血，高剂量组的肾小管上皮细胞轻微肿胀（图3）；高剂量组大鼠的心肌纤维轻度萎缩，心肌间质增宽（图4）；各剂量组大鼠的脾脏组织结构均无异常变化（图5）。说明随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素对大鼠的肝脏、肺脏、肾脏和心脏组织会产生轻微影响，对脾脏组织则无明显影响。

3 讨论

慢性毒性试验是药物安全评价的主要内容之一。本研究选用SPF级Wistar大鼠为试验动物进行恩拉霉素慢性毒性试验，观察大鼠出现的毒性反应及其血液生理生化指标和器官组织病理变化，分析剂量—毒性效应，进一步验证恩拉霉素是否具有潜在的迟发毒性作用，结果发现连续6个月对大鼠进行给药，各恩拉霉素剂量组大鼠的饮食饮水、大小便均正常，精神状态良好，被毛光泽，未出现死亡。模型动物的体质量变化是反映动物机体中毒效应和毒物毒性的最基本指标，而脏器系数是表征药物作用靶器官的重要指标（郭志廷等，2012；刘书伟等，2016）。与对照组相比，各恩拉霉素剂量组大鼠体质量均无显著变化；连续给药3个月后，除高剂量组大鼠肝脏、脾脏和肺脏的脏器系数有显著变化外，其他的脏器系数均无显著变化，中、低剂量组各器官组织的脏器系数也均无显著变化；连续给药6个月后，仅高剂量组大鼠肝脏和脾脏的脏器系数较对照组显著降低，其他的脏器系数均无显著变化。脏器系数虽然是药物安全评价中的一项必需检测指标，但不能依据脏器系数的变化推论靶器官一定出现病例变化（袁本利，2003；刘晓磊等，2013）。因此，必须辅以其他检测指标，包括组织病理切片及血液生理生化指标等。

血液学及血清生化指标是毒理学研究常用测评指标，通过衡量机体血液成分在受试药物作用下的改变情况，从而确定受试药物的毒性作用（张桥，2000；刘霆等，2003）。本研究结果表明，连续给药3个月后，恩拉霉素中、低剂量组大鼠的各项血液常规生理指标均无显著变化，高剂量组仅中性粒细胞较对照组显著下降，在血清生化指标方面也仅表现为高剂量组大鼠的碱性磷酸酶活性显著升高；连续给药6个月后，高、中剂量组大鼠的中性粒细胞较对照组显著升高，而在血清生化指标方面，高剂量组大鼠的谷草转氨酶活性显著下降，高、中剂量组雌性大鼠的白蛋白含量显著升高，其他检测指标变化差异均不显著。可见，恩拉霉素的毒性极低，随着药物剂量的增加及给药时间的延长，仅对大鼠的部分血液常规生理指标和血清生化指标产生轻微影响，即临床用药安全性极高。

组织病理学检查可更加直观地反映药物对靶器官的毒性作用，是药物毒性对机体产生损伤的直接证据（张桥，2000；吴苑滢等，2017）。本研究发现，随着药物剂量的增加及给药时间的延长，恩拉霉素对大鼠的肝脏、肺脏、肾脏和心脏组织会产生轻微影响，主要表现为：高剂量组大鼠肝脏组织中央静脉周围的细胞呈轻微肿胀；肺脏组织有一定程度的淤血，肺间质轻微增宽；肾脏组织轻微充血，且肾小管上皮细胞轻微肿胀；心肌纤维轻度萎缩，心肌间质增宽。这与恩拉霉素对大鼠脏器系数及血液常规生理指标和血清生化指标的影响趋势基本一致，进一步佐证恩拉霉素的毒性极低，临床用药安全性极高。

4 结论

恩拉霉素的毒性极低，随着药物剂量的增加及给药时间的延长，其对大鼠的毒性慢性作用非常轻微，即恩拉霉素的临床用药安全性极高。

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（責任编辑 兰宗宝）