基于时间序列模型评估淀粉样蛋白引起的脑血管内皮功能损伤

朱成燕，刘昊晨，何 华，柳晓泉

(中国药科大学药代动力学教研室，南京 210009)

阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种神经退行性疾病，其发病风险随年龄增加而增大，严重危害老年人健康[1]，目前发病机制尚不明确。流行病学研究表明AD和脑血管疾病之间存在很多共通之处，糖尿病、高血压、肥胖等都是其共同风险因素[2-3]。在AD尚未出现临床症状前，脑血管内皮细胞损伤会加剧神经元损伤，脑血管内皮功能在AD疾病进程中发挥了重要作用[4]。Aβ作为AD疾病进程中的重要生物标记物，大量文献报道其在脑内积聚会引起神经毒性[5]。针对Aβ引起的脑血管内皮细胞损伤进行研究，有助于加深对AD发病机制的理解。

目前文献报道的有关Aβ对脑血管内皮细胞的损伤主要包括线粒体功能损伤和血管舒张障碍。一方面细胞膜上钙离子通道转运活性增加，胞外Ca2+内流增加，线粒体作为调节胞内Ca2+稳态的重要细胞器，当细胞质内Ca2+超载时，线粒体通透性转运孔打开线粒体膜电位(MMP)下降，释放细胞色素C和其他促凋因子，导致细胞死亡[6]。另一方面，Ca2+内流会导致内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性下降，内皮型NO合成减少，造成血管舒张功能受损[7]。相关机制如图1所示。

Figure1 Mechanism of cerebral endothelial impairment induced by beta amyloid (Aβ)

目前对Aβ引起的脑血管内皮功能损伤研究主要集中于机制的探讨，尚无对疾病进程的动态评估。时间序列模型是一种广泛应用的数量分析方法，多用于分析现象随时间变化的波动规律[8]。向量自回归模型(vector autoregressive model，VAR)是最常用的多元回归时间序列分析技术之一，该模型联立多个方程式，且任一内生变量与所有内生变量的滞后值形成回归，可以用来估计联合内生变量之间的动态关系[9]。

本研究根据实验获得Aβ诱导脑血管内皮细胞损伤的时间序列，基于VAR模型描述相关生物标记物之间的动态关系以及评价不同标记物结构冲击的重要性，考察相关标记物对细胞损伤的影响和贡献程度并探讨给药策略。

1 材 料

1.1 试 剂

人源[Gly22]-淀粉样蛋白1-42(美国Sigma公司)；Fluo-4钙离子试剂盒、RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素双抗(美国赛默飞世尔公司)；一氧化氮合成酶检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、L-刀豆氨酸(中国碧云天生物技术有限公司)；牛血清白蛋白(美国Biological Industries Beit Haemek公司)；0.25%蛋白胰酶消化液、无菌DMSO(中国上海翊圣有限公司)；噻唑蓝(中国生兴生物有限公司)；实验用水均为超纯水。

1.2 仪 器

Milli-Q Gradient A10超纯水系统(美国Millipore公司)；万分之一电子分析天平(美国梅特勒托利多公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；生物安全柜、CO2培养箱(美国Thermo公司)；高压灭菌锅(日本Tomy公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.3 细胞株

永生化人脑微血管内皮细胞株由中国药科大学刘晓东教授惠赠。

2 方 法

2.1 HCMEC/D3细胞培养

HCMEC/D3培养于RPMI 1640培养基中，其中含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素，在37 ℃且含5%CO2恒温细胞培养箱中培养。细胞生长至对数期，消化传代，按不同实验要求进行稀释。其中，细胞活力检测法[10]细胞浓度为每毫升1.5×104个，钙离子浓度测定[11]细胞浓度为每毫升2×105个)，eNOS测定[12-13]细胞浓度为每毫升1×105个。将稀释好的细胞悬液按照每孔200 μL接种到预包被的96孔板中，测定线粒体膜电位时将稀释好的细胞悬液(每毫升1×105个)按照每孔1 mL接种到预包被的24孔板中[14]，进行后续实验。

2.2 细胞活力测定

实验分为对照组和Aβ组，对照组为正常培养基，Aβ组为含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培养基。分别培养2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培养基，用无菌PBS缓冲液润洗2遍。每孔加入0.5 mg/mL的噻唑蓝溶液150 μL，在37 ℃细胞培养箱内继续孵育4 h。吸去噻唑蓝溶液，每孔加入DMSO 150 μL，37 ℃振摇温孵10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪在37 ℃下测定，以不含细胞的孔为空白对照，490 nm波长处读取相应吸收度。并使用公式(1)进行计算。

Viability=(AAβ-Ablank)/(Acontrol-Abl)×100%

(1)

式中：AAβ是Aβ组的吸收度；Ablank是空白孔的吸收度；Acontrol是对照组的吸收度。

2.3 钙离子浓度测定

Fluo-4 NW作为一种荧光探针用于检测细胞内钙离子浓度变化。实验分为对照组和Aβ组，对照组为正常培养基，Aβ组为含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培养基。分别培养2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培养基，用无菌PBS缓冲液润洗2遍。每孔加入加样缓冲液100 μL，其中在一空白组加入1%Triton X-100 10 μL视为最大钙离子组，另一空白组加入50 mmol/L EGTA 10 μL视为最小钙离子组，在37 ℃细胞培养箱内继续孵育40 min。直接取该96孔板使用多功能酶标仪在37 ℃下测定，激发波长494 nm，发射波长515 nm，读取相应荧光强度。胞浆钙离子浓度使用公式(2)进行计算。

(2)

式中：Kd为结合常数，一般为345 nmol/L；FAβ为Aβ组荧光强度；Fmin为最小钙离子组荧光强度；Fmax为最大钙离子组荧光强度。

2.4 eNOS活性测试

采用荧光检测探针DAF-FM DA测定eNOS活性。实验分为对照组和Aβ组，对照组为正常培养基，Aβ组为含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培养基。分别培养2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培养基，用无菌PBS缓冲液润洗2遍。按照试剂盒说明书配制NOS检测缓冲液和NOS检测反应液，其中，NOS检测缓冲液中加入L-刀豆氨酸，L-刀豆氨酸终浓度为500 μmol/L。每孔加入NOS检测缓冲液100 μL，再加入检测反应液100 μL，轻轻混匀。在37℃细胞培养箱内继续孵育40 min。使用多功能酶标仪在37 ℃下测定，以不含细胞的孔为空白对照，激发波长495 nm，发射波长515 nm，读取相应荧光强度。以对照组的eNOS活力为1，加了Aβ后eNOS的相对活力使用公式(3)进行计算。

eNOSactivity=(FAβ-Fblank)/(Fcontrol-Fblank)×100%

(3)

式中：FAβ是Aβ组荧光强度；Fblank是空白孔荧光强度；Fcontrol是对照组荧光强度。

2.5 线粒体膜电位测定

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位测定的荧光探针。实验分为对照组和Aβ组，对照组为正常培养基，Aβ组为含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培养基。分别培养2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h后，去除各孔培养基，用无菌PBS缓冲液润洗2遍。按照试剂盒说明书配制JC-1染色液，每孔加入JC-1染色工作液300 μL和培养基300 μL，充分混匀，在37 ℃细胞培养箱内继续孵育20 min。在孵育期间，配制JC-1染色缓冲液，并置于冰浴。37 ℃孵育结束后，用温无菌PBS缓冲液润洗2遍。每孔加入0.05%胰蛋白酶300 μL消化3 min，加入含血清培养基200 μL终止消化，吹打混悬。转速为1 000 r/min，离心5 min，弃去上清液。加入JC-1染色缓冲液300 μL洗涤并重悬细胞，在转速为800 r/min温度为4 ℃条件下离心2 min，沉淀细胞，弃上清液。再加入JC-1染色缓冲液300 μL洗涤并重悬细胞，在转速为800 r/min温度为4 ℃条件下离心2 min，沉淀细胞，弃上清液。加入JC-1染色缓冲液200 μL重悬细胞，并转移至96孔透明底黑板中，使用多功能酶标仪在常温下测定。其中，检测JC-1单体时，激发波长490 nm，发射波长530 nm；检测JC-1聚合物时，激发波长525 nm，发射波长590 nm，读取相应荧光强度。并采用单体/聚合物的形式得到相关数据。

3 时间序列模型

3.1 模型建立

1980年Sims开创性地提出VAR模型，该模型常用于多元回归时间序列分析[9]。VAR(p)模型是基于一系列时间序列的观测值和时间滞后阶数的回归模型，在多个时间序列中捕捉线性关系，将单变量自回归模型推广到由多元时间序列变量组成的向量自回归模型[15]。本研究基于VAR模型对Aβ引起的细胞活力变化与各生物标记物之间的关系进行解析。其中，VAR(p)模型的数学表达式如公式(4)所示。

yt=c+A1yt-1+A2yt-2+…+Apyt-p+εt

(4)

式中，p是滞后阶数，yt是k维内生变量向量，t是一个k维时间序列；c为k维常数项；A1，A2，…，Ap为k×k维待估计的系数矩阵；εt是k维扰动向量项(∑是εt的k维协方差矩阵)，可以同期相关，通常与自己的滞后值不相关，也与等式右边的变量有关。

3.2 模型评估

VAR模型的评估主要采用了可视化预测检验(visual predictive check，VPC)和似然比检验法(likelihood ratio test，LRT)。VPC法以直观方式评价模型的准确性和预测能力，目前在模型预测中广泛应用，但是该方法目前没有合适的统计量，无法从理论上证明模型的合理性，具有一定的局限性。LRT是同时反映模型灵敏度和特异性的复合指标，主要用于检验当前模型是否需要约束。具体来说，比较一个相对复杂的模型与一个简单模型，检验它能否显著地适用于该数据集。LRT提供了一个客观的标准来选择合适的模型。

4 结 果

4.1 脑血管内皮功能损伤相关生物标记物以及细胞活力水平

将HCMEC/D3与含2.5 μmol/L Aβ的RPMI 1640培养基共同孵育，细胞活力和相关标记物水平变化如图2所示。细胞活力随时间下降，在早期快速下降，后期下降速度变慢。细胞活力变化的同时也伴随着相关生物标记物的改变，其中钙离子在早期快速涌入胞浆内，4 h后进入平台期。eNOS在早期快速下降，4 h后变化不大。MMP处于持续下降的状态，前期下降速度快，后期下降速度变慢。

eNOS:Endothelial nitric oxide synthase;MMP:Mitochondrial membrane potential

4.2 时间序列模型估计与结果分析

4.2.1 细胞活力对各生物标记物的脉冲响应分析 基于VAR模型的脉冲响应分析发现在本期给相关标记物包括胞浆Ca2+，eNOS，MMP一个冲击后，细胞活力表现出不同的变化趋势。如图3所示：给胞浆Ca2+一个正冲击后，细胞活力被抑制并持续走低；给eNOS和MMP一个正冲击后，细胞活力上升，并在前期上升速度较快，后期上升速度有所下降。

Figure3 Pulse response analysis of cytosolic calcium ion (A),eNOS (B) and MMP (C) to cell viability

4.2.2 方差解析 基于VAR模型的方差解析发现不同生物标记物对细胞活力贡献程度不同，结果如图4所示。胞浆Ca2+水平对细胞损伤的平均贡献率最大，这种贡献率随疾病进程发展而下降，其次是eNOS，eNOS对细胞活力的影响随着疾病发展而增加，但一直小于胞浆Ca2+。该损伤进程中MMP对细胞活力的影响最小。

Figure4 Variance decomposition of cell viability through biomarkers

4.2.3 时间序列模型的评估 VPC检验如图5所示，观测值大部分落在95%置信区间带，且均匀分布两侧，说明该时间序列模型拟合度良好。无约束的VAR模型和多个有约束的VAR模型(A0，A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7)采用LRT法进行比较，统计参数如表1所示。最终选择了拟合度最好的模型A4，A4的约束关系如图6所示。

Figure5 Visual predicted check for the time series of cytosolic calcium ion(A),eNOS(B),MMP(C) and cell viability(D),σ=0.05.The area between dotted line represents the 95% confidence interval of the simulated median value.The line represents the simulated median value of simulated value.The circle represents the observed value

Table1 Statistical parameters of VAR Stat means statistic,c value means critical value

Model No.P valueStat.c valueA0 vs A11-17.947.81A2 vs A312.803.84A4 vs A51-17.393.84A6 vs A70.142.173.84A0 vs A21-0.613.84A4 vs A61-18.203.84A4 vs A01-0.553.84

A0-A7:represent the model with a different constraint relationship,respectively

Figure6 Schematic diagram of the constraint relation of the model A4

5 讨 论

本研究通过Aβ诱导脑血管内皮功能损伤实验，获得4个时间序列，建立时间序列模型，探讨相关标记物对脑血管内皮细胞损伤进程的影响和贡献度。

首先，0～24 h内胞浆Ca2+、eNOS、MMP水平对细胞活力的动态分析表明给各个生物标记物一个正向冲击后，细胞活力受到影响。其中胞内Ca2+水平对细胞活力具有反向作用，细胞钙超载会引起细胞活力下降。据文献报道细胞钙超载主要通过4个途径激起细胞凋亡：(1)过度激活Ca2+依赖酶，比如钙蛋白酶、钙调磷酸酶，调节凋亡家族Bcl-2蛋白活性[16]，线粒体膜通透性转运打开，从而导致细胞色素C释放，激活半胱天冬酶-3[17]；(2)钙超载激活胱天冬酶-12[18]，间接激活胱天冬酶-3[19]；(3)高浓度胞浆Ca2+水平促进Aβ生成和聚集，直接引起细胞凋亡[20]；(4)胞内钙超载也会影响线粒体功能，线粒体功能受损伴随着胞内活性氧水平增加，线粒体通透性转运孔打开，最终导致细胞死亡[6]。结果与本研究一致。而eNOS和MMP对细胞活力具有正向作用。eNOS分泌的NO能够维持血管正常舒张功能，稳定的MMP有利于维持细胞的正常生理功能。

其次，根据方差解析结果可以看出，在Aβ诱导脑血管内皮细胞损伤进程中，胞浆Ca2+水平对细胞活力的贡献率最大，并且这种影响随疾病进程延长而下降。在损伤早期，胞浆Ca2+主要有两个来源：(1)Aβ作用于细胞膜，使得细胞膜上Ca2+通道活性增加，造成胞浆Ca2+浓度增加[21-22]；(2)Aβ可以激活未折叠蛋白反应，引起内质网钙向胞浆涌入[23]。胞浆Ca2+水平远高于细胞自身对Ca2+的调节范围，引发胞内Ca2+超载。随着疾病进程发展，细胞各方面生理功能发生改变，胞浆Ca2+对脑血管内皮细胞损伤的贡献率度下降，可能有更多机制参与到该损伤进程中，包括炎症、氧化应激、能量代谢障碍等[5]。一方面，线粒体作为主要供能场所，由于胞内钙超载受到损伤，线粒体能量供应不足，影响Ca2+向胞内转运，细胞基本生理活动受到影响；另一方面，线粒体损伤引起胞内ROS水平增加，线粒体内膜脂质和蛋白对氧化应激敏感，脂代谢异常，而内膜损伤加剧线粒体去极化和功能受损[24]。同时，Aβ可以引起诱导性一氧化氮合酶、胞间黏附分子-1、单核细胞趋化蛋白、白介素6等表达增加，这些炎性蛋白都会对脑血管内皮功能造成损伤[5]。据此推断在早期干预钙离子通道有可能改善Aβ引起的脑血管内皮功能损伤，这一观点得到了一些文献支持。临床研究发现干预钙离子通道能够改善脑血管内皮功能，如尼莫地平、氟桂利嗪等钙离子拮抗剂临床上广泛用于各类脑血管疾病[25]，长期使用钙离子拮抗剂能够降低老年痴呆的发病风险[26]，这证明该推断可能是可行的。但是干预钙通道能在多大程度上改善脑血管内皮损伤以及如何影响AD疾病进程还有待进一步研究。

本研究建立了一个有约束的向量自回归模型，该约束关系考虑到了机制中生物标记物之间的关系。同时，适当增加了一些联系使得该模型更趋于合理。该模型只具有统计学意义，而不以严格的生理关系作为依据。一般情况下，我们不纠结于模型的约束关系。本研究的意义在于首次引入VAR模型评估相关生物标记物对细胞损伤的的影响和贡献率，并根据VAR模型推断在损伤早期干预Ca2+通道，调节胞内Ca2+水平，有可能改善Aβ引起的脑血管内皮细胞损伤。