五元杂环并嘧啶类MTH1抑制剂的设计、合成及生物活性评价

王 蕾，马 俊，顾梦月，狄蓉蓉，刘 煜*，赖宜生**

(中国药科大学 1新药研究中心；2生命科学与技术学院，南京 210009)

MTH1(NUDT1)是MutT同源基因家族成员，具有α/β/α MutT超家族折叠结构的特点，其主要生理功能是清除人体内核苷酸池中受自由基氧化损伤所产生的8-氧代鸟嘌呤(8-oxo-dGTP)等产物，以防其掺入DNA复制中，从而确保基因组的稳定性[1-2]。恶性肿瘤的快速增殖导致细胞内线粒体和内质网释放高浓度的自由基，造成DNA氧化损伤，从而产生大量的8-oxo-dGTP。为了清除这些有害的产物，肿瘤细胞就需要更高水平的MTH1。实际上，在肺癌、胃癌和大肠癌等多种肿瘤组织中MTH1的表达明显上调[3-4]。因此，MTH1有望成为肿瘤治疗的新靶点。

目前已报道的MTH1抑制剂主要有金属配体类、嘧啶类、吡啶类和嘌呤类化合物[5](图1)。其中，由瑞典Helleday小组研发的TH1579(Karonudib,结构尚未公布)已于2017年进入Ⅰ期临床试验阶段，用于评价肿瘤患者服用TH1579的安全性和耐受性(NCT03036228)。

Figure1 Representative MTH1 inhibitors

为了寻找新型MTH1抑制剂，本研究以TH287为基础，通过分析8-oxo-dGTP的水解产物及TH287与MTH1蛋白结合的晶体结构，采用闭环、骨架跃迁和生物电子等排等药物设计策略，结合计算机辅助药物设计方法，设计、合成了一系列以嘌呤结构和吡唑并嘧啶为母核的目标化合物(图2)。体外活性测试结果表明，该类化合物显示出良好的MTH1抑制活性，其中7个化合物的IC50小于1 μmol/L，5个化合物(I3,I4,I7-9)的活性与阳性药TH287相当，可以作为新型MTH1抑制剂开展进一步的研究。

Figure2 Design of the target compounds

1 合成路线

化合物I1-10的合成是以6-氯鸟嘌呤与苯硼酸、相应的胺和醇反应得到(路线1)。化合物II1-7的合成是以2-氨基-4,6-二羟基嘧啶为原料，经Vilsmeier-Haack反应和氯代反应一锅法合成2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶甲醛(1)，化合物1经环合反应制得化合物2，化合物2与苯硼酸、相应的胺和醇反应得到(路线2)。目标化合物的结构均经MS和1H NMR确证。

Scheme1 Synthetic route of the target compoundsI1-10

Reagents and conditions:(a) 1,4-dioxane/H2O,reflux;(b) 1-butanol,reflux

Scheme2 Synthetic route of the target compoundsII1,II2-7

Reagents and conditions:(a) POCl3,DMF,reflux;(b) THF/H2O,N2H4-H2O,50 °C;(c) 1,4-dioxane/H2O,reflux;(d) 1-butanol,reflux

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

熔点采用RY-1型熔点仪测定，温度计未经校正；1H NMR使用ACF-300 MHz型核磁共振仪测定，TMS为内标；MS使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap(SL)质谱仪测定；IR采用尼高力iS10傅里叶变换红外光谱仪测定。所有试剂未经特别说明均为市售化学纯或分析纯产品。

2.2 化学合成

6-苯基-9H-嘌呤-2-胺(I1) 将6-氯鸟嘌呤(0.16 g,1 mmol)、苯硼酸(0.17 g,1.2 mmol)、碳酸钾(0.06 g,2 mmol)和二(三苯基膦)二氯化钯加入二氧六环和水(4∶1)的混合溶液15 mL中，氮气保护，回流12 h，旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，柱色谱纯化(EA-PE，3∶1)，得白色固体0.97 mg，收率46%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.06(2H,s,NH2),7.84(1H,m,NH),7.75(1H,m,CH),7.65～7.55(1H,m,ArH),7.44～7.28(4H,m,ArH);ESI-MS:m/z234.10[M+Na]+。

N6-苯基-9H-嘌呤-2,6-二胺(I2) 将6-氯鸟嘌呤(0.16 g,1 mmol)、苯胺(0.11 g,1.2 mmol)溶于正丁醇5 mL，110 ℃下封管反应30 min，加水搅拌，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱色谱纯化(EA-CH3OH，50∶1)，制得淡黄色固体0.15 g，收率67.2%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.30(1H,s,NH),9.30(1H,d,J=4.4 Hz,NH),8.03(2H,d,J=8.3 Hz,ArH),7.88～7.72(1H,m,ArH),7.26(2H,t,J=7.7 Hz,ArH),6.96(1H,d,J=9.6 Hz,CH),6.03(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z227.15[M+Na]+。

用类似的方法制备目标化合物I3-10。

N6-苄基-9H-嘌呤-2,6-二胺(I3) 淡黄色固体0.14 g，收率58.4%。mp:246 ～248 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.08(1H,s,NH),7.72(1H,m,NH),7.46(1H,m,ArH),7.33(2H,t,J=6.8 Hz,ArH),7.27(2H,d,J=7.4 Hz, ArH),7.21(1H,d,J=7.2 Hz,CH),5.69(2H,s,NH2),4.65(2H,s,CH2);ESI-MS:m/z241.15[M+Na]+。

N6-(4-甲基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I4) 淡黄色固体0.15 g，收率61.2%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.96(1H,s,NH),8.27(1H,s,NH),7.82(2H,d,J=8.1 Hz,NH2),7.56(2H,s,ArH),7.21(2H,d,J=8.3 Hz,ArH)),5.32(1H,s,CH),2.31(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z241.20[M+Na]+。

N6-(3-甲基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I5) 淡黄色固体0.15 g，收率60.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.90(1H,s,NH),10.14(1H,s,NH),8.08(1H,s,ArH),7.82(2H,d,J=6.2 Hz,ArH),7.21(1H,dd,J=10.3,6.0 Hz,ArH),6.88(2H,d,J=7.5 Hz,NH2),6.76(1H,s,CH),2.32(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z240.20[M+Na]+。

N6-(4-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I6) 淡黄色固体0.18 g，收率70.4%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.23(1H,s,NH),9.13(1H,s,NH),7.87(2H,d,J=8.8 Hz,ArH),7.77(1H,s,CH),7.02～6.74(2H,m,ArH),5.91(2H,s,NH2),3.73(3H,s,CH3)；ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(3-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I7) 淡黄色固体0.17 g，收率66.8%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.28(1H,s,NH),9.21(1H,s,NH),7.85～7.65(2H,m,ArH),7.59(1H,d,J=8.2 Hz,CH),7.13(1H,td,J=8.1,1.7 Hz,ArH),6.56～6.44(1H,m,ArH),5.99(2H,s,NH2),3.74(3H,d,J=1.8 Hz,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(2-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I8) 淡黄色固体0.20 g，收率77.5%。mp:245～248 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.48(1H,s,NH),10.95(1H,s,NH),8.29(1H,s,ArH),7.76(2H,s,ArH),7.57(2H,s,NH2),7.27(1H,t,J=8.3 Hz,CH),6.99(1H,d,J=7.9 Hz,ArH),2.34(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(4-氟苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I9) 淡黄色固体0.19 g，收率78.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.28(1H,s,NH),9.39(1H,s,NH),8.14～7.91(2H,m,ArH),7.81(1H,d,J=3.3 Hz,CH),7.18～6.95(2H,m,ArH),6.02(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z245.15[M+Na]+。

6-苯甲氧基-9H-嘌呤-2-胺(I10) 白色固体0.18 g，收率74.1%。mp:202～206 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.46(1H,s,NH),7.82(1H,d,J=4.1 Hz,CH),7.58～7.29(5H,m,ArH),6.34(2H,s,NH2),5.48(2H,d,J=4.0 Hz,CH2);ESI-MS:m/z242.15[M+Na]+。

氨基-4,6-二氯嘧啶-5-甲醛(1) 将DMF(2.4 mL,31.5 mmol)于5～10 ℃下缓慢滴加到三氯氧磷(7.5 mL,81.9 mmol)中，后加入2-氨基-4,6-二羟基嘧啶(2 g,15.74 mmol)，室温搅拌30 min，回流24 h，冷却至室温，将反应液缓慢倒入冰水100 mL中，搅拌1 h后静置过夜，抽滤，分别用冰水和乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥得黄色粗品，乙酸乙酯重结晶，得淡黄色固体2.45 g，收率81.3%。mp:>250 ℃(文献值:>250 ℃[6])；IR(KBr,v):3 375.36,3 256.11,2 924.28,2 775.53,1 685.54,1 661.14 cm-1;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.06(1H,s,CH),8.49(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z191.97[M+Na]+。

4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(2) 将化合物1(320 mg,1.7 mmol)溶于四氢呋喃和水(3∶1)混合溶液7 mL中，升温至50 ℃，将水合肼(170 mg,3.3 mmol)溶于水1.7 mL，缓慢滴加至反应液中，搅拌40 min，搅拌下将反应液倒入冰水8 mL中，静置，抽滤，丙酮洗涤，得淡黄色固体0.23 g，收率78.4%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.23(1H,s,NH),7.95(1H,s,CH),7.14(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z168.05[M+Na]+。

4-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(II1) 将化合物2(0.12 g,1 mmol)、苯硼酸(0.2 g,1.2 mmol)、碳酸钾(0.10 g,2 mmol)和二(三苯基膦)二氯化钯加入二氧六环和水(4∶1)的混合溶液15 mL中，氮气保护，回流12 h，旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，柱色谱纯化(EA-PE，3∶1)，得白色固体0.10 g。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:11.94(1H,s,NH),9.85(1H,s,CH),7.74～7.38(5H,m,ArH),6.13(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z212.15[M+Na]+。

N4-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II2) 将化合物2(0.12 g,1 mmol)、苯胺(0.22 g,1.2 mmol)溶于正丁醇5 mL，110 ℃下封管反应30 min，加水搅拌，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，柱色谱纯化(EA-CH3OH，50∶1)，得黄色固体0.18 g，收率78.5%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.60(1H,s,NH),9.47(1H,s,NH),7.98(1H,s,CH),7.93(2H,d,J=8.3 Hz,ArH),7.39～7.11(2H,m,ArH),7.03(1H,t,J=7.3 Hz,ArH),6.27(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z227.15[M+Na]+。

用类似的方法制备目标化合物II3-7。

N4-(4-甲基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II3) 黄色固体0.17 g，收率72.5%。mp:243～245 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.57(1H,s,NH),9.39(1H,s,NH),7.92(1H,s,CH),7.76(2H,d,J=8.0 Hz,ArH),7.12(2H,d,J=8.0 Hz,ArH),6.23(2H,s,NH2),2.27(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z242.15[M+Na]+。

N4-(3-甲基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II4) 黄色固体0.18 g，收率74.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:11.21(1H,s,NH),9.21(1H,s,NH),7.88(1H,s,CH),7.64(1H,d,J=58.9 Hz,ArH),7.12(3H,d,J=84.3 Hz,ArH),5.20(2H,s,NH2),2.41～2.22(3H,m,CH3);ESI-MS:m/z241.15[M+Na]+。

N4-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II5) 黄色固体0.19 g，收率72.5%。mp:237～239 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.67(1H,s,NH),9.43(1H,s,NH),7.99(1H,s,CH),7.61(1H,s,ArH),7.60～7.22(1H,m,ArH),7.21～7.18(1H,m,ArH),6.62～6.61(1H,m,ArH),6.59～6.27(2H,s,NH2),3.78(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N4-(4-氟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II6) 黄色固体0.19 g，收率78.2%。mp:236～239 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.59(1H,s,NH),9.53(1H,s,NH),7.99(1H,d,J=4.1 Hz,CH),7.93～7.90(1H,m,ArH),7.89(1H,s,ArH),7.13(2H,dd,J=10.3,7.1Hz,ArH),6.28(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

4-苯甲氧基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(II7) 白色固体0.18 g，收率73.1%。mp:201～204 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.05～12.61(1H,m,NH),7.86～7.74(1H,m,CH),7.44(5H,d,J=35.0 Hz,ArH),6.61(2H,s,NH2),5.48(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z147.00[M+Na]+。

2.3 MTH1酶活性测试

采用孔雀石绿显色反应对目标化合物的MTH1抑制活性进行评价[7]。向100 mmol/L Tris-醋酸、40 mmol/L氯化钠、10 mmol/L醋酸镁和1 mmol/L DTT配制的反应液中加入MTH1蛋白样品、无机焦磷酸酶(PPase)和反应底物dGTP，25 ℃反应30 min；后加入孔雀石绿、钼酸铵及吐温20显色45 min，酶标仪测定630 nm处吸收度。根据吸收值确定MTH1活性浓度，IC50和曲线拟合由Prism(GraphPad Software)实现。实验结果如表1所示。

Table1 MTH1 inhibitory activities of the target compounds

Compd.RIC50/(μmol/L)I1Ph-9.58I2PhNH-0.119I3PhCH2NH-0.090I4p-CH3-PhNH-0.014I5m-CH3-PhNH-0.17I6p-CH3-O-PhNH-7.36I7m-CH3-O-PhNH-0.029I8o-CH3-OPhNH-0.082I9p-F-PhNH-0.062I10PhCH2O-16.52II1Ph-30.13II2PhNH-17.83II3p-CH3-PhNH-15.67II4m-CH3-PhNH-13.72II5m-CH3-O-PhNH-12.36II6p-F-PhNH-8.60II7PhCH2O-28.17TH2870.012

3 结果与讨论

本研究设计并合成了17个嘌呤和吡唑并嘧啶类化合物，并探究了这些化合物作为MTH1抑制剂的活性。体外活性评价结果表明，大部分化合物对MTH1具有良好的抑制作用。初步的构效分析表明，从母核的结构来看，I类化合物的活性均强于II类化合物(I1vsII1，I2vsII2，I4vsII3，I5vsII4，I7vsII5，I9vsII6，I10vsII7)，说明以嘌呤为母核的活性明显优于吡唑并嘧啶。当苯环与母核直接相连接时，其活性低于苯环通过-NH-与母核相连接(I1vsI2，II1vsII2)，但高于苯环通过-O-与母核相连接(I10vsI3)；当将苯环与母环之间的连接链由-NH-延长至-CH2NH-时活性有所提高(I2vsI3)。同时，还探讨了苯环上不同取代基对于活性的影响。在嘌呤类化合物中，当R处于对位时甲基(I4)和氟(I9)都具有很强活性，而甲氧基(I6)的活性较弱，但是当甲氧基位于间位时，活性则会明显提升(I6vsI7vsI8)，而甲基位于间位时活性反而降低(I4vsI5)。另外，吡唑并嘧啶类化合物的R取代基对于活性的影响微乎其微。

为了进一步说明化合物的构效关系，使用分子对接方法研究了化合物I4与靶蛋白MTH1活性位点中的结合模式(图3)。

Figure3 Proposed binding mode of compoundI4

从图3中可见，嘌呤母环可以与Phe72形成π-π堆积，并且3位N和9位NH分别与关键氨基酸Asp119形成氢键，2位NH2则分别与Asp120和Asn33形成氢键，而且1位N也能与Asn33形成氢键。除此之外，6位上的苯环伸入到蛋白口袋旁边的疏水区内，并且与Tyr 7形成π-π堆积，这可能是化合物I4具有较强活性的主要原因。这些信息为后续结构优化提供了理论基础。