改造酵母降低黄酒中高级醇含量的研究

袁 宁，管桂坤，万自然，夏培禹，刘 宇，王 涛，陈叶福，郑 楠，韩奇颖

（1.山东兰陵美酒股份有限公司，山东临沂277731；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457；3.临沂市环保局，山东临沂276000）

“中国黄酒，天下一绝”，黄酒作为中华民族历史最悠久、最古老的特色酒精饮料，以稻米、黍米等谷物为主要原料，利用麦曲、红曲等所含的多种微生物以及酵母共同发酵酿制而成[1-2]。黄酒酒性柔和，酒味醇厚，已被越来越多的消费者所青睐，同时黄酒含有氨基酸、维生素、微量元素等丰富的营养成分，不仅蛋白质种类丰富，且含量为酒中之最[3]，同时含有酚类物质、功能性低聚糖等功能因子，对人体具有保健作用[4]。

高级醇是指3个以上碳原子醇类的总称，适量的高级醇不仅是酒类的主要呈香物质之一，还能丰富酒的口味，增加其协调性。含量过高则会带来令人不愉快的异杂味，另外，高级醇在体内的氧化速度比乙醇慢，会较长时间停留在体内，消费者饮用后易醉、“上头”，同时会对人体产生一定的危害，引起脑损伤以及认知障碍，使人体神经系统充血、头疼，刺激眼、鼻以及黏膜等[5-6]。目前高级醇的主要来源分为降解代谢途径与合成代谢途径，而生产过程中高级醇含量控制主要从酿造黄酒原辅料、酿造工艺以及发酵工艺中的发酵温度与酿酒酵母等途径解决[7]。本试验通过改造酿酒酵母的添加，初步探索其在黄酒黍米中温大曲和红曲发酵中对高级醇含量的影响。

表1 两种酵母玉米糖液培养期间的总酸和乙酸含量

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

原料及耗材：改造酵母，天津科技大学选育试验用菌株，交由山东兰陵美酒股份有限公司试验用；常规黄酒酵母，安琪酵母股份有限公司；黍米，朝阳益充杂粮有限公司；中温大曲，山东兰陵美酒股份有限公司；红曲，武汉佳成生物制品有限公司。

仪器设备：YXQ-LS-75SN立式压力蒸汽灭菌锅；JHT-系列净化工作台；MJX-280S智能霉菌培养箱；FLY-211C恒温震荡培养箱；安捷伦7890A气相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母培养

糖度为10°Bx的灭菌玉米水解液接入常规黄酒酵母与改造酵母，放入恒温摇床30℃振荡培养24 h后，测其菌数。

1.2.2 试验操作

将浸泡20 h以上的黍米蒸熟，黍米与水以1∶2的比例加入锥形瓶中，待冷至常温，中温大曲和红曲的添加量均为15%，酵母添加量为2.4×108cfu/g，混匀，放入恒温培养箱30℃发酵，6 d后测其高级醇、酒精度、总酸含量等指标。

1.2.3 检测方法

高级醇采用安捷伦7890A气相色谱仪检测、酒精度、总酸等指标均采用常规方法测定[8]。

2 结果与分析

2.1 玉米糖液培养两种酵母产生的总酸及乙酸含量（表1）

黄酒醪液酸败不但会降低原料的出酒率，还会对黄酒风味及品质产生严重影响，甚至导致整个发酵过程失败，对机械化大罐生产造成严重损失[9]。而原料种类、糖化曲质量与用量以及酿酒酵母本身产酸等均会对黄酒醪液酸败产生影响[10]，而由表1可以看出，与常规黄酒酵母相比，相同菌数的改造酵母经过1 d与6 d培养后，总酸含量均相同，说明改造酵母本身没有产生过多的总酸，对黄酒醪液酸败影响不大。经过1 d培养后，两种酵母的菌数相差不大，但经过6 d后，两种酵母菌数差异明显，而改造酵母培养1 d和6 d的菌数差异却不大，推测改造酵母的生长活力要弱于常规黄酒酵母，可能改造酵母进入衰亡期后对环境的抗逆性较差而导致生长受抑制，菌数减少。而改造酵母乙酸的产生量却显著超过常规黄酒酵母，说明改造酵母本身产乙酸的能力较强。

2.2 两种酵母在黄酒中温大曲和红曲发酵6 d后的总酸和乙酸含量（表2）

表2总酸和乙酸含量

由表2可以看出，改造酵母在黄酒中温大曲及红曲发酵期间，总酸含量要稍高于常规黄酒酵母，但当改造酵母的添加量增加一倍，其总酸含量等于或稍小于常规黄酒酵母，推测改造酵母生长活力较弱，对中温大曲中的微生物抑制性较差，导致产酸菌生长，酸度增高，菌数加倍后酵母生长活力增强，对产酸菌的抑制性增强，酸度降低。由于改造酵母本身会产生较多乙酸，所以在黄酒发酵中改造酵母的乙酸含量与常规黄酒酵母相比，显著增高，即使改造酵母添加量加倍，乙酸产量仍显著高于常规黄酒酵母，但稍低于改造酵母的正常添加量组。

表3 两种酵母中温大曲和红曲中发酵6 d后的高级醇含量 (mg/L)

2.3 两种酵母在中温大曲和红曲发酵6 d后的高级醇含量及酒精度（表3、表4）

表4 两种酵母中温大曲和红曲中发酵6 d后的酒精度 (%vol)

由表3可知，与常规黄酒酵母添加量相同以及添加量加倍的改造酵母在黄酒中温大曲及红曲中发酵的高级醇总量均不超过常规黄酒酵母的1/2，说明改造酵母降低高级醇含量显著，在黄酒生产中具有很好的应用前景。而表4显示，与常规黄酒酵母添加量相同的改造酵母发酵6 d后，其酒精度低于常规黄酒酵母，添加量加倍后，其酒精度与常规黄酒酵母接近，进一步说明改造酵母的活力较弱导致其发酵力较弱，酒精度降低。

2.4 两种酵母在中温大曲和红曲中发酵6 d后相关酯的含量（表5）

表5 两种酵母在中温大曲及红曲中发酵6 d后相关酯的含量 (mg/L)

由表5可以看出，改造酵母在中温大曲与红曲中经过6 d发酵后的乳酸乙酯含量明显低于常规黄酒酵母，而且随着改造酵母添加量的增加，乳酸乙酯的含量逐渐降低，这说明改造酵母添加量的增大，可有效抑制乳酸菌等产乳酸杂菌的生长，导致乳酸乙酯前体物质乳酸生成量下降。而中温大曲发酵中，改造酵母的添加使得乙酸乙酯的含量显著高于常规黄酒酵母，且随着添加量的增加乙酸乙酯含量逐渐上升，2倍添加量产生的乙酸乙酯含量接近常规黄酒酵母的8倍，说明改造酵母在黄酒中温大曲发酵中产生的乙酸乙酯为酯香的主体成分。但改造酵母在红曲中发酵的乙酸乙酯含量没有增加，2倍添加量产生的乙酸乙酯与常规黄酒酵母接近，与常规黄酒酵母相同添加量的改造酵母经过6 d发酵后，其乙酸乙酯的含量却低于常规黄酒酵母，由于中温大曲的微生物体系比红曲复杂，可能是中温大曲中存在红曲中没有的相关微生物或酶可以改造酵母产生过多的乙酸转化成乙酸乙酯，从而导致改造酵母在中温大曲发酵期间产生的乙酸乙酯含量显著增加。

3 总结

利用酿酒酵母的筛选或改造是降低黄酒高级醇含量的有效措施，杨鲁君等[11]筛选出来的菌株F-18应用于黄酒生产发酵，实验表明，其高级醇含量低于对照组菌株。王鹏银等[12]诱变出的亮氨酸缺陷型菌株A713，高级醇总量可降低到33.62%，以及YOSHIMOTO H等[13]构建的PDC1缺失突变菌株可使异戊醇的浓度下降31%。

试验所用改造酵母在黄酒酿造中降低高级醇含量非常显著，不论中温大曲还是红曲发酵，与常规黄酒酵母相比，均可将高级醇总量降低多达50%，同时添加量加倍时，发酵产生的酒精度与常规黄酒酵母相近。虽然改造酵母本身产生较高的乙酸，及在黄酒中温大曲和红曲发酵中的菌数与常规酵母相同的添加量所产生的总酸含量稍有增加，但添加量加倍时，总酸含量与常规黄酒酵母相同甚至略低，从而可避免黄酒醪液酸败的发生。改造酵母在中温大曲与红曲发酵中的乳酸乙酯含量明显降低，而且随着改造酵母添加量的增加，乳酸乙酯的含量逐渐下降。而中温大曲发酵中，改造酵母的添加使乙酸乙酯的含量显著高于常规黄酒酵母，且随着添加量的增加，乙酸乙酯含量逐渐上升，添加量加倍产生的乙酸乙酯含量接近常规黄酒酵母的8倍。因此，改造酵母降低高级醇的显著特性在黄酒酿造及新酒品开发中具有很好的应用前景。