夫拉平度对人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用研究

周焕芹

[摘要] 目的 研究周期蛋白激酶（CDKs）抑制劑夫拉平度（Flavopiridol， FP）对人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下移植瘤生长和转移的影响。方法 2017年7—8月在聊城市人民医院中心实验室建立CasKi细胞裸鼠模型，随机分为对照组、顺铂组、FP组及FP和顺铂联合用药组，每组8只裸鼠，4组均于肿瘤抑制成功后瘤体直径平均为0.8 cm开始给药，给药3周，2次/周。最后一次给药5 d后处死全部裸鼠，测量移植瘤的体积和重量，采用免疫印迹法检测对各组中肿瘤组织凋亡蛋白Caspase 3表达的影响，并采用分光光度法测定裸鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。结果 与对照组相比[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g]，顺铂组[（114.50±18.07）V/mm3，（0.12±0.04）m/g]、FP组[（106.74±21.39）V/mm3；（0.10±0.02）m/g]及FP和顺铂联合用药组[（88.59±19.84）V/mm3，（0.07±0.02）m/g]荷瘤体积和重量明显减小（P<0.05）；顺铂组、FP组及FP和顺铂联合用药组Caspase 3表达均显著增加（P<0.05）；与对照组相比[（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]，顺铂组[（143.72±44.45）U/mL，（2.76±2.83）mmol/L]、FP组[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L]及FP和顺铂联合用药组[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L]血清SOD的活性显著升高（P< 0.05），MDA的含量显著降低（P< 0.05）。结论 夫拉平度对人宫颈癌CasKi细胞皮下种植瘤生长具有抑制作用，且与促进癌细胞的凋亡，抑制机体氧化应激反应有关。

[关键词] 夫拉平度；顺铂；宫颈癌；生长抑制；凋亡； 氧化应激

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）04（c）-0018-04

Research on Inhibition Effect of Flavopiridol on the Growth of in Human Cervical Carcinoma CasKi Subcutaneous Implanted in Nude Mice

ZHOU Huan-qin

Department of Pharmacy， Liaocheng Peoples Hospital， Liaocheng， Shandong Province， 252000 China

[Abstract] Objective To study the effect of flavopiridol （FP） on human cervical carcinoma subcutaneous implanted tumor growth inhibition in mice bearing CasKi cell. Methods The nude rat model of cervical cancer cell was established from July to August 2017 in Central laboratory of Liaocheng Peoples Hospital. The nude rat were randomly divided into four groups （control group， cisplatin group， FP group and combined treatment group， 8 rats in each group）， and the four groups were administered when the average tumor diameter was 0.8 cm， 3 w， and 2 times/w， and all the mice were sacrificed in 5 days after the adminitration， and the volume and weight of tumors were tested. And the expression of caspase3 was determined by immunoblotting. And the SOD and MDA levels were measured by the spectrophotometry. Results The tumor volume and weight obviously decreased in the cisplatin group[（114.50±18.07）V/mm3；（0.12±0.04）m/g]， FP group[（106.74±21.39）V/mm3； （0.10±0.02）m/g] and combined treatment group[（88.59±19.84）V/mm3；（0.07±0.02）m/g]（P<0.05） compared with that in the control group[（567.02±89.38）V/mm3；（0.63±0.07）m/g）]， and the expression of caspase 3 in the cisplatin group， FP group and combined treatment group obviously increased compared with that in the control group [（134.68±45.63）U/mL，（3.45±1.47）mmol/L]. The activition of serum SOD in the cisplatin group[（143.72±44.45）U/mL，（2.76 ±2.83）mmol/L]， FP group[（156.51±32.53）U/mL，（2.64±0.66）mmol/L] and combined treatment group[（208.37±63.35）U/mL，（2.38±1.13）mmol/L] obviously increased （P<0.05）， the contents of MDA obviously decreased （P<0.05）. Conclusion FP has an inhibition effect on the growth of in human cervical carcinoma CasKi subcutaneous implanted in nude mice， which is related to promoting the apoptosis of cancer cells and inhibiting the oxidative stress reaction of the body.

[Key words] Flavopiridol； Cisplatin； Cervical carcinoma； Growth inhibition； Apoptosis； Oxidative stress

宫颈癌是危害女性健康常见的恶性肿瘤之一，其发病率较高，在发展中国家妇女中其发病率居第一位，且近年来宫颈癌发病率上升趋势明显[1-2]。因此，寻找治疗宫颈癌的有效方法是目前的研究热点之一。早期宫颈癌治疗后患者5年生存率较高，然而对于中晚期宫颈癌患者，易出现周围组织肿瘤转移，手术和放疗均难取得满意的治疗效果。因此，化疗在宫颈癌治疗中日益受到重视，然而目前化疗药物均存在不良反应大、久用易产生耐药性等缺点，因此寻找选择性高、不良反应小而有效的宫颈癌治疗药物尤为重要。夫拉平度（Flavopiridol， FP）为周期蛋白激酶（CDKs）抑制剂，通过降低肿瘤细胞内紊乱的CDK激酶活性，可以抑制人白血病细胞、食道和胃癌及乳腺癌细胞的增殖[3-4]。另有研究[5-6]报道宫颈癌细胞内CDKs表达较正常组织增加，然而夫拉平度对宫颈癌的治疗作用机制尚未明确。因此，该研究在2017年7—8月间采用人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下种植瘤模型，随机分为对照组、顺铂组、FP组及FP和顺铂联合用药组，每组8只裸鼠，通过给予FP观察FP及FP和顺铂联合用药对宫颈癌裸鼠皮下种植瘤生长不同程度的抑制作用及对血清SOD的影响并探讨其可能机制，以期为宫颈癌新的临床治疗途径提供实验依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

Balb/c雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级饲养，4～6周龄，体重18～22 g， 该研究严格遵守聊城市人民医院动物实验管理相关规定，并通过了伦理委员会审批；人宫颈癌CaSki细胞株购自北京肿瘤研究所；顺铂（6 mL∶30 mg，批号：170603）；兔抗人Caspase-3多克隆抗体购自Cell Signaling；FP购自sigma（批号：S159342）；BCA蛋白浓度检测试剂盒、蛋白质分子量标准、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液和BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒均来自碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞于含RPMI 1640培养基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的培养液中培养，培养液pH 7.2～7.4，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养，更换培养液1次/2～3 d。

1.2.2 宫颈癌裸鼠荷瘤模型的建立 取指数生长期得肿瘤细胞，胰酶消化后，以10%磷酸盐缓冲溶液（PBS）制成浓度为1×107个/mL细胞的细胞悬液中，然后碘伏及75%酒精常规消毒裸鼠左腋下皮肤后，取0.2 mL的CaSki细胞悬液分别注射于裸鼠的左前肢腋下，注射结束后用镊子夹紧针孔，防止细胞悬液渗漏。

1.2.3 分组及治疗 接种结束后将32只棵鼠随机分为对照组、顺铂组、FP组及联用组。自接种后28 d，待裸鼠荷瘤瘤体直径均值（mean tumor diameter， MTD）达8 mm大小时开始给药治疗，对照组以0.2 mL生理盐水腹腔内注射；顺铂组腹腔内注射0.2 mL顺铂（批号：170603），剂量为2 mg/（kg·d）；FP组腹腔内注射0.2 mL FP（批号：S159342），剂量为10 mg/kg；联用组顺铂与FP联合给药[顺铂2 mg/（kg·d），FP 10 mg/kg]。4组均给药3周，给药2次/周。

1.2.4 腹水及盆腔内转移情况 最后一次给药5 d后，脱臼处死全部裸鼠并打开腹腔，仔细检查有无腹水，依次探查腹腔和盆腔内脏器，观察肿瘤转移灶情况。

1.2.5 各组裸鼠皮下移植瘤重量及体积的测量 完整剥离各组肿瘤组织并准确测量肿瘤重量；用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，计算肿瘤体积。体积按照公式V=1/πab2计算（a为瘤块最大径，b為最小径）。

1.2.6 免疫印迹法检测肿瘤组织Caspase-3表达水平 提取肿瘤组织总蛋白，以BCA法进行蛋白定量，加入上样缓冲液。以100 μg上样后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，后100 V恒压转膜。取转移后的硝酸纤维素滤膜，封闭后加入兔抗人激活型Caspase-3（1∶1 000）抗体。膜置于一抗中，4℃ 冰箱过夜孵育。洗膜后以二抗孵育2 h。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT显色液显色。扫描蛋白印迹显影图，利用凝胶自动分析成像软件Image J 软件计算目的蛋白表达的灰度值。

1.2.7 活性测定 裸鼠处死取血，用于测定MDA 含量和SOD 的活性，按照试剂盒规定的方法比色测定吸光度，按公式换算成SOD 的活性以及MDA的浓度的活性。

1.3 统计方法

数据采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，数据以（x±s）表示，组间比较采用one-way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠致瘤率

各组裸鼠均于接种7 d后明显成瘤，移植瘤模型成功建立，接种成功率为100%。

2.2 各组腹水及盆腔转移情况

裸鼠最后一次给药5 d后脱臼处死并解剖，各组裸鼠腹腔内未见腹水，经过腹腔和盆腔各脏器探查，均未见明显转移灶。

2.3 各组裸鼠皮下种植瘤重量及体积差异

与对照组相比，顺铂组、FP组和联合用药组荷瘤体积和重量均显著降低（P<0.05）；此外，与顺铂组相比，联合用药组荷瘤体积及重量均较低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.4 各组裸鼠血清SOD活性和MDA的含量差异

与对照组相比，顺铂组、FP组和联合用药组血清SOD活性均显著提高（P<0.05），MDA的含量显著降低（P<0.05）；与顺铂组相比，联合用药组血清SOD活性均显著提高（P<0.05），MDA的含量显著降低（P<0.05），见表2。

2.5 各组肿瘤组织中Caspase 3蛋白的表达差异

免疫印迹结果显示，顺铂组、FP组和联合用药组肿瘤组织Caspase 3蛋白表达显著升高（P<0.05）；与顺铂组相比，联合用药组肿瘤组织Caspase 3蛋白表达较高。见图1。

3 讨论

细胞周期的正常运行依赖于精细的调控机制，CDK为细胞周期调控网络的核心，具有促进细胞周期时相转变、启动DNA合成、调控细胞转录等重要功能[7-8]。当CDK失调控时，可导致肿瘤的发生、发展，已发现约90%的肿瘤存在CDK的活性增强[9-12]，因此，近几年CDKs已成为肿瘤治疗的重要研究靶点。同时研究显示[4，9，12]，宫颈癌组织和癌旁组织内CDKs过表达，且CDKs的表达与宫颈癌恶性程度、分化等密切相关。

FP为最初来源于一种印度植物的黄酮物质，因具有CDKs抑制活性，其抗肿瘤活性近年逐渐受到关注。近年研究[13]发现FP对白血病细胞、食道和胃癌细胞的增殖具有较好的抑制作用，其中胃癌的肿瘤细胞抑制率可达85%，其抗肿瘤活性与阻断细胞周期、诱导凋亡、抑制血管生长等机制有关。该文研究发现，FP对人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下移植瘤的体积和重量的增加具有显著抑制作用；另外，该研究采用FP联合一线化疗药物顺铂联合用药，发现二者具有协同抗肿瘤作用，其对肿瘤的体积和重量增高的抑制效应显著增强，肿瘤的体积的重量都显著低于对照组。同时发现较对照组，FP和FP顺铂联合用药可显著降低裸鼠血清MDA的含量，提高SOD的活性。这说明FP对宫颈癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用，同时可显著降低机体氧化应激水平，且与顺铂联用大大增强顺铂对宫颈癌的治疗效果。

另外，抑制CDKs可限制肿瘤细胞的过度生长及加速细胞凋亡，已有研究[14]发现FP可使乳腺癌细胞阻滞在G1和G2期，并引起细胞的凋亡，凋亡率可达90%，其机制可能与FP直接抑制CDK2和CDK3的活性有关。该研究发现FP可上调裸鼠肿瘤组织凋亡相关蛋白Caspase 3蛋白的表达，这一结果与前期报道相一致[15]；此外，联合用药组肿瘤组织内Caspase 3蛋白表达较顺铂单独用药组高，这提示，FP对人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞程序化凋亡有关。

综上所述，FP对人宫颈癌CasKi细胞裸鼠皮下种植瘤生长抑制作用，其保护作用与促进肿瘤组织细胞的凋亡及降低机体的氧化应激水平有关；此外，FP与顺铂联合用药可以增强顺铂对宫颈癌生长的抑制效果，该研究将为宫颈癌新化疗药物的研究提供实验依据。

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（收稿日期：2018-01-22）