流感高发季节150例流感病毒核酸阴性的流感样病例鼻咽分泌物呼吸道病毒检测分析

1 材料与方法

1.1 临床资料选择2016年11月～2017年3月间就诊于青海省人民医院、青海省妇产儿童医院和青海红十字医院等3家流感监测哨点医院的ILI患者150例，均符合世界卫生组织(WHO)制定的ILI诊断标准(发热超过 38 ℃，伴有咳嗽、咽痛症状之一，且无其他疾病诊断)，鼻咽拭子标本检测流感病毒均为阴性。150例患者中男81例、女69例，年龄2月～122(16.50±47.25)岁，男女比例为1.17∶1，≤4岁、4～18岁、19～59岁、≥ 60岁者分别为56、22、53、19例。采集其鼻咽拭子标本，保存备用。本研究经本院伦理委员会批准同意，所有患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 ILI患者鼻咽分泌物呼吸道病毒检测取150例患者鼻咽拭子标本，采用西安天隆NP968自动核酸提取仪参照天隆病毒RNA/DNA提取试剂盒(ZTLJB-Y64)说明书提取病毒核酸。采用硕世生物有限公司生产的呼吸道合胞病毒A型和B型核酸检测试剂盒(JC10216N)、腺病毒核酸检测试剂盒(JC10117)、人鼻病毒核酸检测试剂盒(JC10119)和冠状病毒核酸检测试剂盒(JC10305)检测鼻咽拭子标本中的呼吸道病毒。呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠状病毒的反应体系配制如下：7.5 μL核酸扩增反应液，5 μL酶混合液，4 μL病毒反应液，3.5 μL无RNA酶水，加入提取的5 μL RNA模板，配制成25 μL体系，按以下条件进行PCR扩增：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s, 45个循环。55 ℃收集荧光。腺病毒反应体系配制如下：5 μL核酸扩增反应液，0.2 μL酶混合液，4 μL腺病毒反应液，10.8 μL无RNA酶水，加入提取的5 μL RNA模板，配制成25 μL体系，按以下条件进行PCR扩增： 95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s,45个循环，55 ℃收集荧光。

2 结果

150例标本中，病毒阳性检出率29.33%(44/150)。44例中呼吸道合胞病毒22例(14.67%)，其中A型3例(2.00%)、B型19例(12.67%)；腺病毒9例(6.00%)；鼻病毒5例(3.33%)；冠状病毒5例(3.33%)，其中COV-229E 1例(0.67%)、COV-NL63 1例(0.67%)、COV-OC43 3例(2.00%)；混合感染 3例(2.00%)，分别为呼吸道合胞病毒B型合并COV-OC43、腺病毒和鼻病毒。病原谱构成分析显示，呼吸道合胞病毒A型占总体阳性标本的6.81%，B型占43.18%，腺病毒占20.45%，鼻病毒占11.36%，冠状病毒占11.36%，混合感染占6.81%。

44份病毒阳性标本中，男、女性病毒阳性检出率分别为32.10%(26/81)、26.09%(18/69)，性别阳性率差异无统计学意义(χ2=0.650，P=0.420)。≤4岁、4～18岁、19～59岁、≥ 60岁者病毒阳性检出率分别为41.07%(23/56)、36.37%(8/22)、16.98%(9/53)、21.05%(4/19)，不同年龄者病毒阳性检出率间差异具有统计学意义(χ2=8.776，P=0.032)。

4岁以下儿童是呼吸道病毒的主要感染人群，病毒阳性率较高(36.37%)，19～59岁年龄者病毒阳性率最低(16.98%)。呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染多集中在4岁以下儿童。冠状病毒平均分布在各年龄组，≥60岁者人群未检测到鼻病毒感染。见表1。

3 讨论

表1 不同年龄者病毒感染情况[例(%)]

急性呼吸道感染是一组严重危害人类健康的疾病，其传染力极强，传播速度快，发病率占急性传染病的首位，在我国每年都有不同程度的流行。可引起急性呼吸道感染的病原十分复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体和真菌等，尤其是病毒性病原体，可经飞沫传播，具有传染性强、潜伏期短等特点，一些病毒还可引起世界范围的大暴发。此外，急性呼吸道感染易引起患慢性基础性疾病的人群发生多重感染，出现重症和死亡患者，对人类健康造成严重危害，对经济及社会稳定有很大影响。因此，开展系统化、标准化的急性呼吸道感染的病原学监测和特征分析，揭示其流行规律，可为疾病的防治提供科学依据。

目前世界上的许多发达国家已经鉴定出导致ILI的常见病原体，而发展中国家关于 ILI 的流行病学及病因学研究还相对滞后[4, 5]。传统的诊断方法包括病毒分离、免疫分析和电子显微镜技术等，但上述方法不仅费时费力，而且细胞培养对于某些病毒的分离比较困难(如鼻病毒、博卡病毒、人冠状病毒等)，不利于疾病早期诊断和疫情的应急处理。因此需要灵敏度更高，特异性更强、更节省时间的检测方法。随着科技的进步，病毒的诊断已经进入核酸检测的分子水平，荧光定量PCR技术已越来越多地应用于病毒的快速检测。本研究借助流感监测网络平台，应用荧光定量PCR对流感病毒核酸检测为阴性的150份流感样病例标本进行呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和冠状病毒等几种常见呼吸道病毒的核酸检测，以了解西宁市2016年11月～2017年3月流感高发季节期间这4种呼吸道病毒的感染情况。

在150例流感样病例标本中，病毒总检出率29.33%，高于2012～2014年辽宁省的病毒检出率(20.66%)，低于2010～2011年北京市(39.2%)和天津市(66.4%)的病毒检出率[6～8]。分析造成病毒阳性率差异的原因，除确实存在地区差异性，也无法排除采样手法的不同的原因，如果无法保证每份样本都能收集到上皮细胞，就可能造成假阴性，降低检出率。另外，还可能是采集标本的不同，下呼吸道样本病毒阳性率相对上呼吸道样本要高一些。检测结果显示，男性病毒检出率为32.10%，女性病毒检出率为26.09%，性别检出率无显著差异。但年龄是呼吸道病毒易感性的影响因素，除冠状病毒外，呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染人群主要集中在4岁以下婴幼儿，可能与婴幼儿呼吸道病原的抗体保护水平低有关。4种病毒中，呼吸道合胞病毒是西宁市此时期引起呼吸道感染比较重要的病原，感染率最高，为14.67%，高于广州(10.63%)、西安(10.78%)、上海(7.3%)等地，低于武汉地区(22.92%)[9～12]，其中B型流感病毒感染率相对较高，占全部呼吸道合胞病毒检出的86.36%(19/22)。本研究中，感染率位于呼吸道合胞病毒之后的为腺病毒(6.00%)，研究表明人腺病毒导致呼吸道感染检出率为8.9%～10.5%左右，主要感染5岁以下儿童，与本研究结果基本相似[13]。鼻病毒也是ILI的常见病原体，本研究中鼻病毒检出率为3.33%，显著低于2006～2007年兰州地区鼻病毒感染率(13%)[14]。研究[15]显示冠状病毒感染因地理位置不同差异较大，其感染率一般在0.4%～1.4%之间，也显著低于本研究结果(3.33%)。此外，本研究中混合感染为3例，感染率为2.00%，与北京、上海地区的混合感染率2.24%和2.54%较为接近，且3例混合感染均为 RSVB联合其他病毒，表明呼吸道合胞病毒较易发生混合感染[16, 17]。可见，ILI病原谱存在一定的地域差异，有必要对多个地区的病原谱信息进行进一步研究。

儿童因免疫功能低下，易成为急性呼吸道感染的主要高发人群，严重影响患儿的健康和成长发育，因此需做好相关预防措施，以减少或控制疾病，保障患儿健康成长。其中，RSVB为感染率最高的病毒，主要感染4岁以下婴幼儿，并且是最易发生混合感染的病毒，是西宁地区婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体。本研究结果提示在婴幼儿中防控呼吸道合胞病毒感染，对降低西宁地区婴幼儿呼吸道感染的发病率有比较重要的意义，为当地呼吸道感染防治策略的制定提供了重要参考依据。

综上所述，ILI患者存在呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和冠状病毒等病毒感染。≤4岁ILI者多发呼吸道合胞病毒、腺病毒和鼻病毒感染。