抑制miR-182表达对人乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响及其机制

董超，黄远丽，徐正丰

(华中科技大学同济医学院附属荆州医院，湖北荆州434020)

乳腺癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。我国乳腺癌发病率逐年升高，且具有年轻化趋势，已成为我国女性肿瘤性死亡的最常见原因[1]。近年基因变异导致相关功能因子表达紊乱在乳腺癌的发生、发展中作用相关研究是目前肿瘤研究热点[2]微小RNA(miRNA)表达失衡在乳腺癌中作用的研究越来越受到关注[3,4]。miR-182是miRNA家族重要成员之一，其定位于人7号染色体(7q32.2)，与miR-96、miR-183形成一个基因簇。miR-182表达异常与结直肠癌[5]、原发性肉瘤[6]、肺癌[7]等许多恶性肿瘤的发生发展密切相关。但目前有关miR-182在乳腺癌中表达情况的研究甚少，并且作用机制尚不明确。Forkhead转录因子(FOXO1)是miR-182的下游调控靶基因，在恶性肿瘤[8,9]、阿尔茨海默病、帕金森疾病[10]、成骨细胞分化[11]等多种生理、病理过程中发挥重要作用。2017年10月～2018年3月，我们观察了抑制miR-182对人乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响，并探讨其可能作用机制。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-182在人乳腺癌组织和细胞中表达情况，观察其对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，并进一步探讨可能的下游调控机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2015年1月华中科技大学同济医学院附属荆州医院手术切除的乳腺癌组织标本89例及距肿瘤边缘5 cm以上的癌旁组织标本，组织离体30 min内液氮速冻，-80 ℃保存备用。89例均为女性患者，术前均未接受放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗。患者均对本研究知情同意，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、试剂及仪器 人乳腺癌细胞SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮细胞HBL-100均购自美国ATCC，于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。miR-182 inhibitor(可抑制miR-182表达)和inhibitor-NC购自上海吉玛制药公司。

1.3 癌组织、癌旁组织miR-182检测方法 采用时荧光定量PCR(qRT-PCR)法。取癌组织、癌旁组织标本。采用TRIzol Reagent提取组织总RNA，RNA的纯度和浓度用核酸定量仪检测，吸光度OD260 nm/OD280 nm为1.8～2.0表示RNA纯度合格。取100 ng总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书的步骤制备cDNA保存备用。取cDNA和引物，配置PCR反应体系，反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。miR-182 引物序列：上游引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′,下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以2-△△Ct表示miR-182的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100细胞miR-182检测方法 取对数生长期SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和HBL-100， 采用qRT-PCR法检测细胞miR-182，操作方法同“1.2”。实验重复3次，取平均值。

1.5 抑制miR-182对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响

1.5.1 细胞分组及miR-182 inhibitor转染方法 取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于6孔板，分为观察组、对照组，每组6个复孔。细胞密度达80%时观察组和对照组采用LipofectamineTM2000分别转染miR-182 inhibitor、inhibitor-NC，所有操作均严格按照使用说明书进行。qRT-PCR检测转染效率结果显示，观察组、对照组细胞miR-182相对表达量分别为0.18±0.09、1.01±0.04(P<0.01)，证明转染效成功。

1.5.2 细胞侵袭情况观察 采用Transwell侵袭实验。基质胶包被Transwell小室底膜上室面，收集转染24 h两组细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，饥饿处理24 h，取250 μL加入小室上室，下室加入500 μL含10% 胎牛血清的DMEM培养基,培养箱培养24 h后取出小室，PBS洗涤2遍，棉签轻柔擦去上室面残余细胞，4%多聚甲醛固定,染色。倒置显微镜观察小室下室细胞数目。以侵袭细胞数代表细胞侵袭情况。实验重复3次，取平均值。

1.5.3 细胞迁移情况观察 采用Transwell实验。Transwell小室底膜的上室面不给予基质胶包被，余操作步骤同“1.3.2”。

1.5.4 两组细胞FOXO1 mRNA和蛋白检测方法 采用qRT-PCR法检测细胞FOXO1 mRNA。采用Western blotting法检测细胞FOXO1 蛋白。取转染24 h两组细胞，抽提细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每个样本取50 μg总蛋白上样，10% SDS-PAGE分离，采用湿转法电转移至硝酸纤维素膜，5 %脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗FOXO1、GAPDH和二抗，孵育后ECL显影液显影，以Quality One软件分析条带灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 癌组织、癌旁组织miR-182相对表达量比较 癌组织、癌旁组织miR-182相对表达量分别为6.60±0.53、1.02±0.05，二者比较，P<0.05。miR-182表达与乳腺癌患者TNM分期及淋巴结转移有关(P均<0.01)，而与年龄、肿瘤直径、组织学分级、ER状态、C-erbB-2状态、PR状态无关(P均>0.05)。见表1。

2.2 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100细胞miR-182相对表达量比较 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231及HBL-100细胞miR-182相对表达量分别为5.46±0.20、4.50±0.47、6.63±0.71、1.03±0.04，与HBL-100相比，SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231细胞miR-182相对表达量升高(P均<0.01)。

2.3 两组侵袭细胞数、迁移细胞数比较 观察组、对照组侵袭细胞数分别为(53±10)、(118±19)个，二者比较，P<0.05；观察组、对照组迁移细胞数分别为(78±9)、(181±17)个，二者比较，P<0.05。

表1 miR-182表达与乳腺癌临床病理参数的关系(例)

2.4 两组细胞FOXO1 mRNA和蛋白相对表达量比较 观察组、对照组FOXO1 mRNA相对表达量分别为11.16±0.79、1.06±0.06，二者比较，P<0.05；观察组、对照组FOXO1蛋白相对表达量分别为1.19±0.17、0.35±0.11，二者比较，P<0.05。

3 讨论

肿瘤转移是乳腺癌患者死亡的首要原因，发生转移的乳腺癌患者预后差，生存期短。转移的乳腺癌细胞常伴随着对传统治疗药物的耐药性，现有肿瘤治疗药物对于组织学形态多样、高度异质性的乳腺癌仍显不足。

miRNA是近年来发现的一类长度较短的单链非编码RNA，与靶基因的3′非翻译区互补结合，诱导靶基因mRNA降解或者抑制其翻译，从而实现对靶基因表达的调控作用[12]，在机体细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程中发挥着重要的作用。miRNA作为一类新的癌基因或者抑癌基因，其表达失衡在恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用，通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等肿瘤生物学特性影响恶性肿瘤的发生及进展[13]。miR-182由Lagos-Quintana等[14]由2003年研究小鼠眼睛中miRNAs表达情况时发现，miR-182与视力的发育及相关疾病相关[15]。近年研究显示，miR-182在结直肠癌[5]、原发性肉瘤[6]、宫颈癌[8]、前列腺癌[9]、肝细胞癌[16]等多数恶性肿瘤中表达增高，起癌基因作用。但在肺癌[7]、胶质瘤[17]等少数恶性肿瘤中表达降低，起抑癌基因作用。因此miR-182在恶性肿瘤发生、发展中的作用机制复杂，其具体的作用机制尚不明确。本研究发现，乳腺癌组织miR-182相对表达量高于相对应癌旁组织，SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231细胞miR-182相对表达量高于HBL-100，提示miR-182可能作为着癌基因参与乳腺癌的发生。miR-182的表达与乳腺癌TNM分期及淋巴结转移有关，与年龄、肿瘤直径、组织学分级、ER状态、C-erbB-2状态、PR状态等临床病理特征无关。在不同的肿瘤临床分期及淋巴结转移组间miR-182表达水平有显著差异，Ⅲ+IV期乳腺癌组织中miR-182的表达水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴结转移乳腺癌组织中miR-182的表达水平明显高于无淋巴结转移者，提示乳腺癌组织中miR-182的表达与乳腺癌的临床进展有关。

增殖、侵袭及迁移等是恶性肿瘤细胞最基本的肿瘤生物学行为，研究已经证实抑制多种肿瘤细胞中miR-182的表达升高可明显抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等细胞生物学行为[5，6，8，9，17]。本研究发现，抑制细胞miR-182表达能够明显抑制MDA-MB-231的侵袭和迁移能力。FOXO1是FOX蛋白家族的一个重要成员，可作为一种肿瘤抑制因子参与恶性肿瘤的发生进展。FOXO1在乳腺癌组织和细胞中表达均降低[18]，上调乳腺癌组织中FOXO1的表达能够抑制瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[19]，起着抑癌基因的作用。近期Tang等[8]在研究中发现miR-182通过下调FOXO1表达在宫颈癌中发挥癌基因的作用。Wallis 等[9]报道在前列腺癌中miR-182通过抑制FOXO1的表达促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。本研究发现，下调miR-182能够明显上调MDA-MB-231细胞FOXO1 mRNA和蛋白相对表达量，提示miR-182在乳腺癌中可能也可以通过调控FOXO1基因的表达来发挥作用。

综上所述，乳腺癌组织中miR-182高表达。抑制miR-182表达可抑制MDA-MB-231细胞的侵袭、迁移，其机制可能为上调FOXO1的表达。