血浆甲基化透明质酸酶-2检测对胰腺癌的诊断效能

郝一,张煦,李红超 ,鲍美华

(1 长沙医学院基础医学院，长沙410219； 2兰州大学基础医学院；3湖南省肿瘤医院；4长沙医学院)

胰腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，患者中位生存期3～6个月，五年生存率不足5%[1]。病理组织活检是目前临床胰腺癌的诊断金标准，其他辅助诊断方式包括以糖类抗原CA19-9为主的血浆肿瘤标志物、影像学检查以及内镜等方法。癌胚抗原(CEA)是临床常用的肿瘤相关抗原。CA19-9是应用最广泛和临床价值最高的胰腺癌肿瘤标志物，但其在胃肠道肿瘤、急慢性胰腺炎及肝硬化等非胰腺恶性肿瘤疾病中均能出现[2]。CT检查是疑似胰腺肿瘤的首选影像学检查，但胰腺癌早期缺乏特异性的影像学表现，影像学检查在胰腺癌的早期诊断敏感性和特异性均不理想[3]。胰腺癌患者早期常缺乏明显临床症状，确诊时只有15%～20%的患者可行手术治[4]。晏冬等[5]关研究发现，DNA甲基化对胰腺癌的诊断尤其是其早期诊断，具有重要价值。透明质酸酶-2(HYAL2)是一种抑癌因子，可降解透明质酸，参与细胞黏附、 细胞运动、细胞迁移、血管生成和新陈代谢等过程。目前关于甲基化HYAL2水平在胰腺癌诊断中的应用情况相关报道较少。本研究观察了64例胰腺癌患者外周血甲基化HYAL2水平，探讨外周血甲基化HYAL2水平对胰腺癌的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月～2017年12月间我院收治的疑似胰腺癌患者125例，其中男66例、女59例，年龄41～65(52.42±11.35)岁。排除标准：①既往胰腺癌相关放化疗者；②合并其他部位原发性恶性肿瘤者；③合并严重的心、肝、肺等其他脏器病变者。125例患者均行手术切除胰腺组织并行病理学检查。经组织病理学检查分为胰腺癌组64例(观察组)，其中男34例、女30例，年龄42～64(51.89±11.62)岁；均为胰腺导管腺癌，根据UICC第六版胰腺癌TNM分期Ⅰ期26例、Ⅱ期38例，血红蛋白含量(Hb)(11.23±3.21)g/dL，白细胞计数(WBC)(8.01±5.34)×103/L，血小板计数(PLT)(105.32±70.12)×103/L，尿素(BUN)(4.72±3.34)mmol/L，碱性磷酸酶(ALP)(80.79±21.64)U/L，血浆淀粉酶(AMS)(190.52±171.12)U/L，脂肪酶(LPS)(341.56±83.61)U/L，总胆红素(TBil)(20.32±1.29)μmol/L，直接胆红素(DBil)(7.42±1.96)μmol/L。观察组术后病理可见实性肿物，边界不清，质硬，灰白或灰黄色，弥漫浸润胰腺实质，受累的导管或小导管常扩张。部分组织出现实性癌巢，腺管不规则，癌细胞核极向消失，可见细胞异型性。胰腺良性疾病患者61例(对照组)，其中男32例、女29例，年龄40～66(53.12±13.85)岁；其中慢性胰腺炎38例、胰腺囊肿15例、胰腺假性囊肿8例，Hb(12.16±2.08)g/dL，WBC(9.27±5.47)×103/L，PLT(107.32±73.23)×103/L，BUN(4.43±3.11)mmol/L，ALP(83.32±24.01)U/L，AMS(658.12±67.43)U/L，LPS(632.34±52.98)U/L，TBil(16.54±1.39)μmol/L，DBil(6.56±1.78)μmol/L。慢性胰腺炎患者术后病理可见腺泡组织呈不同程度萎缩，间质弥漫性纤维组织增生和淋巴细胞、浆细胞浸润，导管轻度扩张。两组年龄、Hb、WBC、PLT、BUN、ALP、TBil、DBil等指标间差异无统计意义。对照组血浆AMS、LPS水平高于观察组(P均<0.05)。所有患者及家属均签署知情同意书，本研究获伦理委员会批准。

1.2 血浆甲基化HYAL2检测方法 取两组空腹静脉血，2 500 r/min离心，分离血浆，-30 ℃保存备用。引物及探针由上海生工生物工程有限公司辅助设计及合成；2×TAG PCR MIX为北京欧比特有限公司产品；实时荧光定量PCR仪器为Life Technologies公司产品。

应用DNA提取试剂盒提取血浆DNA并用Alpha-1900紫外分光光度仪测定DNA浓度及纯度；取1 μg提纯DNA按照操作说明书进行进行亚硫酸氢盐化修饰；2 μL修饰后DNA进行MSP；Meth Premier5.0软件设计甲基化特异引物、非甲基化特异引物序列见表1；PCR反应总体系为25 μL，PCR buffer 2.5 μL， 2 μL dNTP mixture 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Tap酶0.125 μL，修饰后DNA模板4 μL。 PCR反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；取5 μL部分扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，另取5 μL扩增产物送威斯腾生物有限公司用MethyLight定量PCR方法进行甲基化HYAL2水平定量检测,使用甲基化百分比参数(PMR)来描述甲基化HYAL2。

表1 HYAL-2甲基化/非甲基化特异引物序列

2 结果

观察组、对照组分别有2、13例扩增出甲基化HYAL2阳性片段，片段长度111 bp。观察组、对照组甲基化HYAL2检出率分别为20.3% (13/64)、3.3%(2/61)，二者比较，P<0.05。观察组、对照组血浆甲基化HYAL2的PMR分别为26.12%±10.11%、46.54%±18.86%，二者比较，P<0.05。

观察组、对照组血浆CEA分别为(23.02±11.96)、(13.17±7.84)ng/mL，二者比较，P<0.05；观察组、对照组血浆CA19-9分别为(215.39±38.05)、(26.40±20.31)U/mL二者比较，P<0.05。多因素Logistic回归分析结果显示，血浆CA19-9、CEA及甲基化HYAL2是胰腺癌的影响因素。见表2。

相关性分析结果显示，胰腺癌患者血浆甲基化HYAL2水平与血浆CEA、CA19-9均呈负相关(r=-0.755，-0.512；P均<0.05)。

表2 血浆AMS、LPS、CA19-9、CEA及甲基化HYAL2水平对胰腺癌诊断的多因素回归分析结果

血浆甲基化HYAL2诊断胰腺癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.804，最佳诊断点34.435%，其敏感度为73.8%，特异度为85.3%；血浆CEA诊断胰腺癌的AUC为0.597，最佳诊断点为16.97 ng/mL，其敏感度为51.6%，特异性为68.9%；血浆CA19-9诊断胰腺癌的AUC为0.775，最佳诊断点为162.49 U/mL，其敏感度为75.0%，特异性为79.2%；因血浆CA19-9的AUC高于血浆CEA，故做血浆甲基化HYAL2与血浆CA19-9联合诊断胰腺癌的诊断效能。血浆甲基化HYAL2与血浆CA19-9联合诊断胰腺癌的AUC为0.873。

3 讨论

胰腺癌是一种病死率非常高的恶性肿瘤，是世界第七大癌症致死的病因[6]。如果对肿瘤直径<1 cm的胰腺癌患者行手术为主的综合治疗，则5年生存率可接近100%。所以，发现胰腺癌的早期检测方法迫在眉睫。而周原等[7]研究表明，DNA甲基化对胰腺癌的早期具有潜在的临床价值，具有比传统肿瘤标志物更高的灵敏度和特异度。

HYAL2是一种抑癌因子，作为一种降解透明质酸的酶，参与细胞黏附、 细胞运动、癌症演进、血管生成和新陈代谢等过程。HYLA2基因低甲基化可能导致该基因表达下调或沉默，最终导致胰腺癌的发生和发展。Xiao 等[8]研究表明，随着检验技术的提高，外周血中循环肿瘤细胞DNA甲基化的检测灵敏度有很大提升，有望成为胰腺癌早期筛查，无创的检测方法；并且，DNA甲基化作为一种核酸类的肿瘤标记物，在胰腺癌的诊断方面具有传统肿瘤标记物所没有的优势,比如容易被检测到、经济成本低以及早期即可出现等特点[9, 10]。

胰腺癌的病因和发病机制较为复杂，早期无明显特异性症状，发现时往往已至进展期，出现人体多个器官的损害，进而导致肝肾功能等多项指标的改变[11]。本研究中，将胰腺癌患者的常规检测项目比如血常规和较为特异性的肿瘤标志物CA19-9，以及新指标HYLA甲基化纳入单因素及多因素Logistic回归分析。单因素分析发现对照组患者AMS、LPS和血浆甲基化HYLA2水平大于观察组组；观察组患者血浆CA19-9、CEA均高于对照组。提示上述指标与胰腺癌的发生有密切联系。经多因素分析显示血浆CEA、CAA19-9以及血浆甲基化HYLA水平是胰腺癌的独立影响因素，根据OR值对从胰腺疾病中鉴别胰腺癌的影响力依次为：血浆甲基化HYAL2、血浆CA19-9、CEA，且血浆CA19-9较CEA稍准确。这与Chang 等[12]关于胰腺癌早期诊断的研究一致。

将甲基化HYLA2的PMR值分别与血浆CEA、CA19-9进行相关性分析，发现PMR值与两者均呈负相关，说明随着血浆CEA、CA19-9增高，甲基化HYAL2水平呈下降趋势，进而提示血浆低甲基化的HYLA2水平与胰腺癌的发生具有密切关系，同传统指标一样，对胰腺癌的诊断具有一定临床价值。血浆甲基化HYLA2与血浆CA19-9联合诊断的AUC最大，其次是血浆甲基化HYLA2，CEA的AUC最小。并且血浆甲基化HYLA2单独诊断胰腺癌的特异度较高，敏感度稍低，提示血浆甲基化HYAL2诊断胰腺癌的潜在临床价值可能优于常规指标，且血浆甲基化HYAL2与血浆CA19-9联合诊断，能够进一步提升其诊断效能，有望成为胰腺癌患者筛查的可靠指标。

然而，本实验只检测了血浆样本的甲基化HYLA2，并未对外周血各样本中HYLA2进行研究和分析，也未与胰腺组织、胰液等其他样本进行对照研究，因此可能低估了血浆甲基化HYLA2对胰腺癌的诊断价值。因此，仍需前瞻性研究和大样本随机对照试验，以明确血浆甲基化HYLA2对胰腺癌早期的诊断价值。

综上所述， 胰腺癌患者血浆甲基化HYAL2发生率较高。血浆甲基化HYAL2诊断胰腺癌的灵敏度、特异度均较高。血浆甲基化HYAL2联合CA199检测有助于胰腺癌的诊断。