不同产地菱角壳(欧菱果壳)中总多酚含量及抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的比较

左袁袁， 吕 寒， 吴月娴， 陈 剑， 简暾昱， 任冰如，①， 李维林

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心， 江苏 南京 210014； 2. 南京林业大学， 江苏 南京 210037〕

国产菱属(TrapaLinn.)植物仅包含欧菱(T.natansLinn.)和细果野菱(T.incisaSieb. et Zucc.)2种[1]，全国各地均有分布，长江流域为主要分布区和栽培区。该属植物的果实统称为菱角，《本草纲目》中记载菱角具有解暑、解伤寒积热、止消渴和解酒毒的功效；子叶富含淀粉，可食用；菱角壳具有降血糖、抗氧化、抗癌和抗肿瘤等[2-4]药理活性，含黄酮类[5-6]、总多酚类[3，6]、萜类和甾体类[7]、苯丙素类[6]以及生物碱类[8]等成分，主要活性成分为总多酚。

为明确不同产地菱角壳中总多酚含量的差异，作者对来源于11个省(自治区)13个产地的菱角壳中总多酚含量进行测定，并对其抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用进行了比较，以期为菱角壳的深度研究和开发提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试欧菱果实于2017年8月取自广西(桂林)、山东(枣庄)、浙江(嘉兴和金华)、河南(信阳)、湖北(洪湖)、福建(建瓯)、安徽(马鞍山)、湖南(沅江)、江西(新余)、江苏(南京和苏州)和广东(揭阳)11个省(自治区)的13个产地，经江苏省中国科学院植物研究所任冰如研究员鉴定。各产地分别采集新鲜欧菱果实(菱角)约1kg，人工剥取菱角壳，自然阴干，粉碎，过60目筛，备用。

主要仪器：EL204电子天平〔梅特勒-托利多(上海)有限公司〕、SpectraMax Plus384光吸收酶标仪(美国Molecular Devices公司)、KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、Thermo Finnpipette精密单通道加样器(美国Thermo Fisher Scientific公司)和Transferpette-8型精密八通道移液排枪(德国Brand公司)。

主要试剂：没食子酸对照品(纯度大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)、α-葡萄糖苷酶(美国Sigma-Aldrich公司)、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG，纯度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、Folin-Ciocalteu试剂(美国Sigma-Aldrich公司)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(分析纯，上海生工生物工程有限公司)；K2S2O8、Na2PO4·12H2O、K2PO4、无水乙醇和Na2CO3均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制 精密称取没食子酸对照品适量，用超纯水溶解并配制成质量浓度99.70 μg·mL-1的对照品溶液，并按照文献[9]的方法，采用Folin-Ciocalteu试剂法测定吸光度。以吸光度为纵坐标(y)、没食子酸含量为横坐标(x)绘制标准曲线，获得回归方程y=0.411 6x+0.206 2(r=0.997 5)，线性范围0.000 0～4.990 0 μg。

1.2.2 样品中总多酚的提取 通过前期对提取溶剂(体积分数40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇以及50%丙酮)的预实验确定以体积分数60%乙醇为提取溶剂。分别称取各样品粉末1.00 g，精密加入体积分数60%乙醇50.0 mL，超声(300 W，30 ℃)提取40 min，冷却后过滤，滤液即为总多酚提取液。用体积分数60%乙醇将总多酚提取液稀释4倍，制成供试样液。分别精密量取供试样液5 μL，按对照品溶液的测定方法测定吸光度，并根据标准曲线计算样品中的总多酚含量。每份样品均重复测定3次。

1.2.3 方法学考察 精密吸取对照品溶液5 μL，按对照品溶液的测定方法，连续测定6次吸光度，RSD值为0.04%，表明仪器精密度良好。取湖北洪湖产样品的供试样液，按对照品溶液的测定方法测定吸光度，并分别显色反应0、20、40、60、80、100和120 min，RSD值为1.20%，表明供试样液显色后在2 h内稳定性较好。取湖北洪湖产样品粉末6份并按上述方法制成供试样液，按对照品溶液的测定方法测定吸光度，RSD值为0.80%，表明该方法重复性较好。取广西桂林产样品粉末(总多酚含量已知)6份，每份0.05 g，分别加入体积分数60%乙醇50 mL和质量浓度99.70 μg·mL-1没食子酸对照品溶液7.5 mL，按上述样品中总多酚的提取和测定方法测定吸光度，并且计算回收率，平均回收率为99.96%，RSD值为0.08%。

1.2.4 抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定 用体积分数60%乙醇将上述各样品的总多酚提取液稀释16倍，制成供试样液。分别测定供试样液对DPPH·和ABTS+·的清除率及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率[10]。

1.3 数据统计分析

采用GraphPad Prism 6软件对数据进行差异显著性分析，采用EXCEL 2013软件对数据进行相关性分析。

2 结果和分析

不同产地菱角壳样品中总多酚含量及其总多酚提取物对DPPH·和ABTS+·的清除率及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率见表1。结果表明：浙江嘉兴产样品中总多酚含量最高(54.54 mg·g-1)，山东枣庄产样品中总多酚含量最低(8.15 mg·g-1)且与其他产地样品中总多酚含量差异显著(P<0.05)；其他产地样品中总多酚含量均存在不同程度的差异。

产地Location总多酚含量/(mg·g-1)Total phenols contentDPPH·清除率/%DPPH· scavenging rateABTS+·清除率/%ABTS+· scavenging rateα-葡萄糖苷酶活性抑制率/%α-glucosidase activity inhibition rate广西桂林Guilin of Guangxi15.11±0.03e33.76±1.58h22.54±1.07j34.43±1.09h山东枣庄Zaozhuang of Shan-dong8.15±0.01f44.01±1.89g25.80±1.04i29.65±1.02i浙江嘉兴Jiaxing of Zhejiang54.54±0.02a80.60±4.47a70.19±3.68a78.02±3.74a浙江金华Jinhua of Zhejiang38.05±0.04b48.76±2.65f55.41±2.12d57.85±1.56d河南信阳Xinyang of He’nan34.85±0.02b77.76±4.47a55.38±2.79d53.23±1.63e湖北洪湖Honghu of Hubei35.54±0.01b75.51±3.30b52.22±1.48e55.24±2.86d福建建瓯Jian’ou of Fujian27.46±0.04d66.24±1.04d58.36±2.86c41.73±1.30g安徽马鞍山Ma’anshan of An-hui32.50±0.02c74.66±3.85b49.16±2.39f49.12±1.45f湖南沅江Yuanjiang of Hu’nan30.12±0.03c66.42±2.65d55.53±1.77d47.44±1.79f江西新余Xinyu of Jiangxi31.71±0.03c61.98±1.82e45.38±2.19g47.30±2.24f江苏南京Nanjing of Jiangsu39.70±0.05b72.56±3.91c54.77±2.83d66.17±2.88c江苏苏州Suzhou of Jiangsu13.39±0.01e44.85±2.79g34.19±1.53h29.09±2.00i广东揭阳Jieyang of Guangdong47.87±0.09a73.48±3.77c63.86±4.75b71.82±3.60b

1)以体积分数60%乙醇为溶剂 Taking volume fraction of 60% ethanol as solvent. 同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

浙江嘉兴产样品的总多酚提取物对DPPH·和ABTS+·的清除率最高，分别达到80.60%和70.19%；广西桂林产样品的总多酚提取物对DPPH·和ABTS+·的清除率最低，分别仅为33.76%和22.54%，且与其他产地的样品差异显著。浙江嘉兴产样品的总多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高(78.02%)；江苏苏州产样品的总多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最低(29.09%)，且总体上与其他产地的样品差异显著。总体上看，不同产地样品的总多酚提取物均具有清除DPPH·和ABTS+·的活性及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，但不同产地间存在差异。浙江嘉兴产样品中总多酚含量及其总多酚提取物对DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均显著高于其他产地。

相关性分析表明：菱角壳中总多酚含量与其DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均呈显著正相关，相关系数分别为0.788、0.916和0.977。

3 讨论和结论

上述实验结果表明：不同产地菱角壳中总多酚含量及其总多酚提取物对DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均存在差异，除与各产地栽培品种本身的遗传差异有关外，还可能与产地的气候和水土环境等因子以及栽培管理措施有关。

菱角壳分为内果皮和外果皮，内果皮由质地坚硬的木质化纤维组织组成，而外果皮呈膜质，在果壳总质量中占比很小，但却是总多酚及其他化学成分存在的主要场所。从果皮结构上看，浙江嘉兴产菱角壳的内果皮相对较薄且质地较疏松，在果壳质量中占比相对较小，而其外果皮占比相对较大，总多酚含量相对较高，因而，浙江嘉兴产菱角壳中总多酚含量及其总多酚提取物对DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率总体上显著高于其他产地。

相关性分析表明：菱角壳中总多酚含量与其总多酚提取物对DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均呈显著正相关，表明多酚类成分可能是菱角壳抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要活性成分。相关研究表明：氧化应激与糖尿病[11]、肿瘤[12]和炎症[13]等疾病密切相关，因此，菱角壳可作为抗糖尿病及其他疾病的药用植物资源进一步研究和开发。鉴于浙江嘉兴产菱角壳中总多酚含量较高，且抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均较强，可首先用于研究和开发。