紫丁香查尔酮异构酶基因SoCHI的克隆及表达分析

王 蕊， 李彦慧， 郑 健

(1. 北京农学院园林学院 北京林果业生态环境功能提升协同创新中心， 北京 102206； 2. 河北农业大学园林与旅游学院， 河北 保定 071000)

黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，在植物花色形成过程中具有重要作用。查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)在黄酮类化合物的合成过程中起关键作用，能够催化查尔酮异构化为4，5，7-三羟基黄烷酮(naringenin)，并在其他酶的催化作用下形成不同的黄酮类化合物[1]。1967年，Moustafa等[2]首先从大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中纯化获得第1个CHI蛋白；20年后，Mehdy等[3]首次从菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)中克隆获得CHI基因的cDNA序列；随后，研究人员从玉米(ZeamaysLinn.)[4]、碧冬茄〔Petuniahybrida(J. D. Hook.) Vilm.〕[5]、银杏(GinkgobilobaLinn.)[6]、番薯〔Ipomoeabatatas(Linn.) Lam.〕[7]和金鱼草(AntirrhinummajusLinn.)[8]等植物中均克隆到CHI基因。近年来，通过基因工程技术调控CHI基因表达、改变植物花色的研究屡见报道[9-11]，对于观花植物花色育种具有重要意义。

紫丁香(SyringaoblataLindl.)又名华北紫丁香，隶属于木犀科(Oleaceae)丁香属(SyringaLinn.)，为落叶灌木。紫丁香适应性强，耐寒、耐旱、耐瘠薄，病虫害较少，并具有花序硕大、开花繁茂及花色和花香独特等特点，是一种极具观赏价值的园林植物；该种可孤植、对植或片植，常作为公园、庭园和街头绿地的观花灌木广泛应用于中国北方园林绿化。目前，关于紫丁香的研究主要集中在花期[12]、繁育技术[13]和抗逆生理[14]等方面，而关于其花色的研究尚处于起步阶段，仅见关于紫丁香花色素生物合成相关基因[15]的研究报道以及肉桂酸4-羟化酶基因(SoC4H)时空表达模式[16]的研究报道。实际上，紫丁香花拥有从浅粉色到紫色再到深紫色等多种颜色，然而关于其花呈色的分子机制尚未清楚，阻碍了紫丁香花色育种研究进展。

为了探明紫丁香花色形成的分子机制，作者采用RACE技术从紫丁香花中克隆获得CHI基因的cDNA全长序列，对该基因编码蛋白质的理化性质、氨基酸序列同源性以及结构和功能进行了分析，并采用实时荧光定量PCR技术对该基因在紫丁香不同器官和花期的表达特性进行了研究，以期明确紫丁香花色形成的分子机制，为利用基因工程技术培育紫丁香新品种提供理论基础和备选基因。

1 材料和方法

1.1 材料

在北京农学院林木种质资源圃内选择生长健壮且无病虫害的紫丁香植株，采集叶片和花，置于-80℃冰箱中保存，分别用于总DNA和总RNA的提取；在该种质资源圃中随机选择3株生长健壮且无病虫害的紫丁香植株，在东、南、西、北4个方向分别采集嫩枝、嫩叶、成熟叶、花和根，并在花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期采集样株的花，单株样品混匀后置于-80℃冰箱中保存，分别用于不同器官和花期紫丁香CHI基因的表达特性分析。

实验使用的RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、2×EasyTaq® PCR SuperMix、质粒提取试剂盒、pEASY-T载体和大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司，切胶回收试剂盒和SYBR®PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司，3′RACE和5′RACE试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；引物合成及测序工作均由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 紫丁香CHI基因的克隆 参照李荣华等[17]的改良CTAB法提取紫丁香叶片的总DNA。

使用RNA提取试剂盒，按照说明书操作流程提取紫丁香花的总RNA；按照RNA反转录试剂盒说明书上的操作流程将提取的总RNA进行反转录，获得cDNA第1条链。使用BLASTn软件(https：∥blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将Zheng等[15]测序获得的紫丁香CHI基因序列与NCBI数据库中其他植物的CHI基因序列进行比对，确定CHI基因的保守区；根据该基因的保守区序列设计引物SoCHI-1F和SoCHI-1R

(引物序列分别为 5′-T￣T￣G￣G￣A￣A￣C￣C￣T￣A￣C￣A￣C

C￣G￣A￣T￣G￣C￣T-3′和5′-A￣A￣C￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣A￣A￣T￣T￣A-3′)，以cDNA第1条链为模板进行扩增反应，获得紫丁香CHI基因cDNA序列的中间片段；设计3′RACE引物SoCHI-2F和SoCHI-3F(引物序列分别为5′-C￣C￣A￣G￣A￣A￣T￣C￣C￣G￣G￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣T￣A￣T￣A￣G-3′和5′-C￣G￣G￣A￣A￣G￣C￣A￣G￣T￣G￣C￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣C￣T￣A￣T￣A￣A￣T￣T￣G￣G￣C-3′)，以cDNA第1条链为模板，使用3′RACE试剂盒进行扩增反应，获得紫丁香CHI基因cDNA序列的3′端片段；设计5′RACE引物SoCHI-2R和SoCHI-3R(引物序列分别为5′-G￣G￣A￣A￣A￣G￣T￣T￣T￣C￣G￣T￣T￣C￣T￣T￣G￣A￣A￣G￣A￣C￣C-3′和5′-C￣T￣C￣C￣A￣A￣G￣A￣A￣C￣T￣T￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣G￣C￣T￣T￣T￣A￣G￣A￣C-3′)，以cDNA第1条链为模板，使用5′RACE试剂盒进行扩增反应，获得紫丁香CHI基因cDNA序列的5′端片段。扩增产物经电泳检测、胶回收、连接载体、转化大肠杆菌、检测阳性克隆和测序后，使用DNAMAN 7.0软件将扩增获得的紫丁香CHI基因cDNA序列的中间片段、3′端片段和5′端片段进行拼接，获得紫丁香CHI基因的cDNA全长序列。

设计能够扩增出紫丁香CHI基因的完整开放阅读框(ORF)的引物SoCHI-4F和SoCHI-4R(引物序列分别为5′-A￣T￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣G￣T￣C￣G￣C￣C￣G￣A￣C￣C￣G￣T-3′和5′-T￣C￣A￣A￣T￣T￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣G￣T￣G￣G￣C￣C￣T-3′)，分别以cDNA第1条链和总DNA为模板进行扩增反应，扩增体系总体积20.0 μL，包括cDNA第1条链或总DNA 1.0 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，2×EasyTaq®PCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 8.2 μL。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共30个循环反应；72 ℃延伸10 min。扩增产物经电泳检测、胶回收、连接载体、转化大肠杆菌和检测阳性克隆后进行测序。

1.2.2 紫丁香CHI基因序列分析及编码蛋白质特性分析 使用DNAMAN 7.0软件寻找紫丁香CHI基因cDNA序列的开放阅读框，预测该基因编码蛋白质的氨基酸序列；使用NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中的BLASTp软件对该基因编码蛋白质的氨基酸序列进行保守域预测，并与NCBI网站UniProt数据库中其他植物CHI蛋白的氨基酸序列进行同源性比对；使用ExPASy(http：∥www.expasy.org/)网站中的Compute PI/MW tool工具对该基因编码蛋白质的理论相对分子质量和理论等电点进行分析；同时，使用GOR4和Swiss-Model软件分别对该基因编码蛋白质的二级和三级结构进行预测分析。

1.2.3 紫丁香CHI基因的表达特性分析 参照苑笑阳等[18]的方法，以SoActin7为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术对紫丁香嫩枝、嫩叶、成熟叶、花和根以及花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期花中CHI基因的相对表达量进行检测，每个单株视为1个重复，共3个重复。使用的荧光定量PCR扩增引物为SoCHI-5F 和 SoCHI-5R (引物序列分别为5′-C￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣T￣A￣G￣A-3′ 和5′-G￣A￣A￣T￣C￣C￣G￣G基因的相对表达量进行检测G￣A￣A￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣T￣A￣G￣A-3′)，内参基因扩增引物为SoActin-7F 和 SoActin-7R(引物序列分别为 5′-T￣G基因的相对表达量进行检测G￣A￣A￣T￣G￣T￣G￣C￣T￣G￣A￣G￣A￣G￣A￣T￣G￣C-3′ 和5′-T￣G￣C￣T￣G￣A￣C￣C￣G￣T基因的相对表达量进行检测A￣T￣G￣A￣G￣C￣A￣A￣A￣G-3′)。使用Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)进行扩增反应，扩增体系总体积25.0L，包括cDNA模板1.0L，上游引物和下游引物各1.0L，SYBR®PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5L，ddH2O 9.5L。根据2计算紫丁香CHI基因在不同器官和花期的相对表达量。

2 结果和分析

2.1 紫丁香CHI基因cDNA和gDNA的全长序列分析

扩增结果表明：以紫丁香花中cDNA第1条链为模板扩增获得的紫丁香CHI基因cDNA序列的中间片段长度为247 bp(图1-A)，通过与NCBI数据中的数据进行比对，该片段编码的蛋白质与多种植物CHI基因编码的蛋白质的同源性达90%以上；根据同源特异片段序列分别设计3′RACE和5′RACE特异引物进行扩增，分别获得紫丁香CHI基因cDNA序列的3′端片段(图1-B)和5′端片段(图1-C)，序列长度分别约为270和460 bp；将上述3个片段测序后进行拼接，获得紫丁香CHI基因的cDNA全长序列，命名为SoCHI。根据SoCHI基因3′端片段和5′端片段的序列设计引物，分别以紫丁香cDNA第1条链和总DNA为模板，扩增获得该基因cDNA(图1-D)和gDNA(图1-E)的全长序列，经比对，SoCHI基因的cDNA序列与拼接后得到的cDNA序列一致，并且，该基因无内含子，全部由外显子构成。

分析结果(图2)表明：SoCHI基因的开放阅读框(ORF)长度为684 bp，编码227个氨基酸残基，编码的蛋白质为SoCHI蛋白。

M： DNA marker； A： 中间片段 Intermediate fragment； B： 3′端片段 3′ terminal fragment； C： 5′端片段 5′ terminal fragment； D： cDNA全长序列 Full-length sequence of cDNA； E： gDNA全长序列 Full-length sequence of gDNA.图1 紫丁香SoCHI基因的扩增结果Fig. 1 Amplification result of SoCHI gene in Syringa oblata Lindl.

： 底物结合位点 Substrate binding site； □： 氢键结合位点 Hydrogen bond binding site； ▲： 活性催化位点 Active catalytic site； *： 终止密码子 Stop condon.图2 紫丁香SoCHI基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列Fig. 2 cDNA sequence of SoCHI gene in Syringa oblata Lindl. and its amino acid sequence encoded

2.2 SoCHI蛋白特性分析

2.2.1 理化性质分析 分析结果表明：SoCHI蛋白的理论相对分子质量24 988，理论等电点pI 5.53；其氨基酸序列包含21个带正电荷的氨基酸残基〔精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)〕和24个带负电荷的氨基酸残基〔天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)〕，并且，丝氨酸(Ser)、Lys、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和亮氨酸(Leu)含量较高；SoCHI蛋白的不稳定系数为47.58，说明该蛋白质属于不稳定蛋白；其平均亲水指数为-0.096，说明该蛋白质为亲水性蛋白。

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 将SoCHI蛋白的氨基酸序列与NCBI网站UniProt数据库中其他植物CHI蛋白的氨基酸序列进行比对，桂花(OsmanthusfragransLour.)、油橄榄(OleaeuropaeaLinn.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)、金花茶(CamellianitidissimaChi)、忍冬(LonicerajaponicaThunb.)、金鱼草、黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、芍药(PaeonialactifloraPall.)和石榴(PunicagranatumLinn.)9种植物与紫丁香CHI蛋白的氨基酸序列相似性较高，同源性比对结果(图3)表明：紫丁香与同科植物桂花(登录号为ALL27265.1)和油橄榄(登录号为AHI86005.1)CHI蛋白的同源性最高，为88%；其与黑果枸杞(登录号为AHH86092.1)、金花茶(登录号为ADZ28513.1)、忍冬(登录号为AGE10599.1)、金鱼草(登录号为BAO32070.1)、黄芩(登录号为AMW91737.1)、芍药(登录号为AEK32592.1)和石榴(登录号为AHZ97871.1)CHI蛋白的同源性也较高，均在76%以上。

So： 紫丁香 Syringa oblata Lindl.； Of： 桂花 Osmanthus fragrans Lour.； Oe： 油橄榄Olea europaea Linn.； Lr： 黑果枸杞 Lycium ruthenicum Murr.； Cn： 金花茶 Camellia nitidissima Chi； Pl： 芍药 Paeonia lactiflora Pall.； Pg： 石榴 Punica granatum Linn.； Am： 金鱼草 Antirrhinum majus Linn.； Sb： 黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi； Lj： 忍冬 Lonicera japonica Thunb.图3 紫丁香及其他9种植物CHI蛋白氨基酸序列的同源性比对Fig. 3 Homology comparison on amino acid sequences of CHI protein in Syringa oblata Lindl. and other nine species

2.2.3 结构及功能位点分析 对SoCHI蛋白二级结构的预测分析结果表明：在SoCHI蛋白的二级结构中，α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别包含72、46和109个氨基酸残基，各占氨基酸残基总数的31.7%、20.3%和48.0%。对SoCHI蛋白的三级结构进行建模(图4)，该蛋白质三级结构模型的QMEAN得分为0.78，且该蛋白质的三级结构与拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕AtCHI蛋白三级结构的相似性为67.3%。

图4 紫丁香SoCHI蛋白的三级结构Fig. 4 Tertiary structure of SoCHI protein in Syringa oblata Lindl.

对SoCHI蛋白功能位点的分析结果(图2)表明：该蛋白质含有2个保守的氢键结合位点、2个活性催化位点和7个底物结合位点，氢键结合位点分别位于第50位的苏氨酸(Thr)和第108位的酪氨酸(Tyr)处；活性催化位点分别位于第115位的天冬酰胺(Asn)和第208位的Ser处，底物结合位点分别位于第38位的Arg处、第39位的Gly处、第40位的Leu处、第49位的苯丙氨酸(Phe)处、第52位的异亮氨酸(Ile)处、第111位的Lys处和第112位的缬氨酸(Val)处。这些位点均高度保守且相对位置保持不变。

2.3 SoCHI基因在紫丁香不同器官和花期的表达特性分析

2.3.1 在不同器官的表达特性分析 研究结果(图5)表明：SoCHI基因在紫丁香的花、嫩叶、成熟叶、嫩枝和根中均有表达，但其相对表达量存在明显差异，表现为在嫩叶中最高，在成熟叶中次之，在花中也较高，在嫩茎中较少，在根中极低。

F： 花 Flower； TL： 嫩叶 Tender leaf； ML： 成熟叶 Mature leaf； TS： 嫩茎 Tender stem； R： 根 Root.图5 紫丁香不同器官中SoCHI基因的相对表达量Fig. 5 Relative expression level of SoCHI gene in differennt organs of Syringa oblata Lindl.

2.3.2 在不同花期的表达特性分析 研究结果(图6)表明：SoCHI基因在紫丁香花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期均有表达，但其相对表达量存在明显差异，表现为在花蕾期最高，在花芽期次之，在初花期和盛花期较低，在末花期最低。

FB： 花芽期 Flower bud stage； B： 花蕾期 Budding stage； EF： 初花期 Early flowering stage； FF： 盛花期 Full flowering stage； LF： 末花期 Late flowering stage.图6 不同花期紫丁香花中SoCHI基因的相对表达量Fig. 6 Relative expression level of SoCHI gene in flower of Syringa oblata Lindl. at different flowering stages

3 讨论和结论

紫丁香是中国北方地区常见的乡土树种之一，亦是国内重要的木本花卉种类，花色和花香独特，被广泛用于园林绿化。本研究成功获得紫丁香查尔酮异构酶(CHI)完整的同源基因，命名为SoCHI，该基因的开放阅读框(ORF)长度为684 bp，编码227个氨基酸残基，编码的蛋白质为SoCHI蛋白。相关研究结果表明：CHI基因为多基因家族，且基因的结构变异较大，如油橄榄的OeCHI基因及Lotusjaponicus(Regel) K. Larsen的LjCHI1和LjCHI3基因均包含4个外显子和3个内含子[19-20]，大麦(HordeumvulgareLinn.)的HvCHI基因包含3个外显子和2个内含子[21]，芸薹属(BrassicaLinn.)植物的BrCHI-2、BoCHI-2和BnCHI-2基因均包含6个外显子和5个内含子[22]。与上述植物CHI基因不同的是，紫丁香SoCHI基因无内含子。

蛋白质二级结构预测结果表明：无规则卷曲在SoCHI蛋白的二级结构中所占比例最大(48.0%)，α-螺旋次之(31.7%)，延伸链最小(20.3%)。另外，SoCHI蛋白的氨基酸序列具有保守的氢键结合位点、活性催化位点和底物结合位点，与油橄榄和金花茶等植物CHI蛋白的结构相似[19，23]，属于查尔酮合酶超家族。同源性比对结果表明：紫丁香SoCHI蛋白与蔷薇科(Rosaceae)、山茶科(Theaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、茄科(Solanaceae)、唇形科(Lamiaceae)及芍药科(Paeoniaceae)植物CHI蛋白的氨基酸序列同源性略低于同科植物油橄榄和桂花的CHI蛋白，表明CHI蛋白的氨基酸序列在不同植物中相对保守。

本研究中，SoCHI基因在紫丁香嫩叶中的相对表达量最高，其次为成熟叶，这可能是紫丁香嫩叶色素积累并呈现紫红色的重要原因。相关研究结果[24-26]表明：查尔酮异构酶处于植物体内黄酮类化合物合成途径的上游，对黄酮类化合物等次生代谢产物的合成具有重要作用，并且，CHI基因主要在生命活动较旺盛的器官中表达。

周兴文等[23]的研究结果表明：CHI基因在植物花呈色过程中起重要作用，且植物的花色素苷含量随该基因表达量升高而升高。在紫丁香花发育过程中，SoCHI基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势，在花发育早期特别是花蕾期最高，这一研究结果与紫丁香花蕾期花蕾颜色浓于盛花期和末花期花冠裂片颜色的现象相吻合。另外，CHI基因在金花茶[23]和红掌(AthuriumandraeanumLind.)[27]等植物花发育过程中也存在类似的表达模式。根据上述研究结果推测CHI基因的表达量在不同植物花发育前期明显升高有助于植物体内花色素的积累。

综上所述，SoCHI基因无内含子，全部由外显子构成；SoCHI蛋白属于不稳定蛋白和亲水性蛋白，其氨基酸序列相对保守；并且，SoCHI基因的表达与紫丁香花呈色关系密切。