不同株系丹参有效成分比较研究

梁从莲，张永清，李佳，刘谦，蒲高斌

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

丹参为唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎，具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦等功能，对心血管等疾病作用显著[1-3]。近年来丹参临床应用范围不断扩大，市场需求逐年增加。目前丹参在我国各省均有种植，但品质差异较大。长期以来，丹参优良品种选育的工作相对比较滞后，缺乏优良品种的推广，从而限制了丹参产业的健康发展[4-6]。丹参有效成分按溶解性可分为脂溶性和水溶性化学成分。2015版中国药典以丹参酮ⅡA作为其脂溶性代表成分，以丹酚酸B作为水溶性代表成分，进行含量控制[7]。本研究选取包括丹参酮ⅡA在内的4种脂溶性成分和包括丹酚酸B在内的3种水溶性成分进行含量测定，将有效成分的含量作为评价丹参种质优劣的标准之一，探讨活性成分的含量变化规律，比较不同株系丹参之间的有效成分的差异，为进一步的丹参优良种质的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

1.1.1 实验材料

本实验所用原植物均来自于山东中医药大学药用植物园，经山东中医药大学张永清教授鉴定，确认均为3年生唇形科丹参。根据株型、株高、花色、茎色、芽色、叶色和叶片大小等诸多方面的差异，确定为10个株系的丹参。

1.1.2 试剂

丹酚酸 B(PA048RA13)、迷迭香酸(20120809)、紫草酸(PF0225SA14)、丹参酮ⅡA(20130111)、二氢丹参酮Ⅰ(KN1113GH14)(上海源叶生物科技有限公司)；丹参酮Ⅰ(批号：110867-200406)、隐丹参酮(批号：110852-200806)(中国食品药品研究院)；甲醇(AR)、乙腈(GR)(天津市富宇精细化工有限公司)；磷酸(GR)(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物学性状测定

于2016年4月份开始对所研究丹参的外观性状，包括质量性状(如芽色，花色，茎色，叶色等)和数量性状(如株高，冠幅，叶，花，芽的大小等)进行观察和测量。其中除芽的指标在4月份进行外，其他指标均在丹参盛花期7月中旬进行。取丹参芽，烘干杀青，研成粉末用色差仪测定其亮度、红-绿值和黄-蓝值。其他数量性状借助卷尺、游标卡尺、棉线等工具，质量性状主要通过肉眼观察。每种株系测量10株，每株测量茎3枝，茎底部叶片3片,花序轴底部花3朵。每株系共获得茎指标10项，叶指标30项，花指标30项。

1.2.2 取样方法

2016年10月底采挖10种不同株系丹参的根部，除去泥沙。置烘箱中烘干至恒重，粉碎后用于含量测定。

1.2.3 对照品溶液制备

(1)水溶性成分：分别精密称取干燥的水溶性对照品紫草酸0.72 mg、迷迭香酸0.30 mg、丹酚酸B 5.98 mg，置10 mL棕色量瓶中，75%甲醇溶解后定容，质量浓度分别为72、30、598 μg /mL。

(2)脂溶性成分：分别精密称取干燥的脂溶性对照品丹参酮ⅡA 0.56 mg、丹参酮Ⅰ0.18 mg、隐丹参酮0.54 mg，二氢丹参酮0.14 mg置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，质量浓度分别为56、18、54、14 μg/mL。用时稀释成等梯度浓度。

1.2.4 供试品溶液制备

取丹参粉末约0.5 g(过40目筛)，精密称定，置于洗净烘干的磨口锥形瓶中，用移液管向其中加入甲醇50 mL，置于超声清洗器中50 ℃超声，40 min后取出放冷，摇匀，过滤，续滤液过0.45 mm滤膜，即得脂溶性成分样品溶液。水溶性成分样品溶液制备方法同脂溶性样品，但是提取溶剂改为75%甲醇。

1.2.5 色谱条件

其中色谱柱采用Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相采用两相流动相，分别为0.026%磷酸(A相)和乙腈(B相)。洗脱时采用梯度洗脱，但两大类成分洗脱程序和检测波长存在较大差异。水溶性成分的洗脱程序为：0～15 min，A相83%～77%，B相17%～23%；15～30 min，A相77%～75%，B相23%～25%；30～40 min，A相75%～10%，B相25%～90%；40～60 min，A相10%，B相90%。波长286 nm。脂溶性成分的洗脱程序为：0～20 min，A相80%～40%，B相20%～60%；20～60 min，A相40%～20%，B相60%～80%。波长270 nm；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

1.2.6 方法学考察

(1)精密度试验：取同1号样品液连续进样6次，计算色谱峰相对保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

(2)重复性试验：取1号样品5份，分别制得5个供试品溶液，进样，计算色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD，结果RSD均小于3%，说明仪器重复性良好。

(3)稳定性试验：取1号样品溶液，进样后，再分别隔2、4、6 、12 h各进样一次，计算色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD，结果RSD均小于3%，表明7种成分稳定性良好。

(4)线性关系考察：分别吸取不同体积的二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 7种成分的标准品，分别以甲醇和75%甲醇溶解并稀释制成10个不同质量浓度的系列溶液。按1.2.4所述色谱条件进行测定，以对照品的质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行回归处理，得到7个回归方程，如表1 所示。

表1 丹参各活性成分对照品回归方程Table 1 The regression equation of the active components of S.miltiorrhiza

1.2.7 数据分析

采用SPSS17.0对所得数据进行显著性和相关性分析。

2 结果

2.1 生物学性状

对10种株系的芽颜色进行测定，结合色差仪和肉眼观察结果(表2)，按芽颜色区分10种株系可大体分为3类：浅紫(a<2,b>1.46)，深紫(a>3.5,b<0.5)和介于两者之间的紫色。

表2 不同株系丹参芽颜色Table 2 The color of S.miltiorrhiza buds in different strains

注：L表示亮度，a表示红-绿值，b表示黄-蓝值。a值越大，表示颜色越偏于红，越小则偏于绿；b值越大越偏于黄，越小越偏于蓝。

表3 不同株系丹参数量性状均值统计Table 3 Mean statistics of quantitative characters of S.miltiorrhiza in different strains

注：A表示所测每轮小花数的均值，B代表10 cm花序上的小花总数的均值。

图1 不同株系丹参花的照片Fig.1 Photos of the S.miltiorrhiza flowers in different strains

表4 不同株系丹参整体性状Table 4 The overall characters of different S.miltiorrhiza strains

结合表3，4及图1以及原始数据分析，10种株系株高分布在35～85 cm之间，冠幅分布在1 017.876～13 171.32 cm2之间，平均分枝数3～23不等；茎长分布在30.5～79 cm之间，茎宽分布在4.03～7.32 mm之间；叶柄长分布在0.206～3.1 cm之间，叶长分布在2.7～12.7 cm之间，叶宽分布在1.7～3.9 cm之间，叶面积分布在5.59～34.73 cm2之间；花长分布在1.6～2.9 cm之间，花宽分布在0.8～2.2 mm之间，花轮间距分布在1～2.44 cm之间，每轮小花数3～9朵不等，柱头长分布在1.9～4.4 cm之间。由此可知，10种丹参在植株形态上存在较大差异，可作为区分不同株系的性状依据，在此基础上,我们进行了后续的含量测定研究。

2.2 有效成分HPLC色谱峰

选取10种丹参株系的4种脂溶性成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和3种水溶性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B进行含量测定，标准品和样品色谱图见图2和图3。

1 迷迭香酸；2 紫草酸；3 丹酚酸B。图2 水溶性成分HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of water-soluble components

1 二氢丹参酮Ⅰ；2 隐丹参酮；3 丹参酮Ⅰ；4 丹参酮ⅡA。图3 脂溶性成分 HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of fat-soluble components

从图2、3可以看出在本研究所用色谱条件下，4种脂溶性成分和3种水溶性成分与对照品保留时间一致，且各峰分离度较好。

表5 丹参活性成分含量(%，X±SD)Table 5 The content of active ingredients of different S.miltiorrhiza strains (%, X±SD)

注：相同字母代表两组数据之间无显著性差异，有显著性差异的用不同字母表示。

由表5可知，二氢丹参酮Ⅰ的含量分布在0.023 3%～0.114 8%，隐丹参酮的含量分布在0.093 5%～0.397 4%，丹参酮Ⅰ的含量分布在0.037 2%～0.140 7%，丹参酮ⅡA的含量分布在0.066 2%～0.386 1%，迷迭香酸的含量分布在0.120 7%～0.287 5%，紫草酸的含量分布在0.194 5%～0.608 9%，丹酚酸B的含量分布在2.179 5%～5.215 1%。其中3、7号株系的丹参酮ⅡA含量最高，另三种脂溶性成分含量也较高，但其水溶性成分含量较低，且7号丹酚酸B的含量还不能达到药典要求，鉴于此，可考虑将其作为脂溶性成分的提取原料用于工业提取。1、9、10号株系的丹酚酸B的含量较高，同理可考虑作为水溶性成分的提取原料用于工业提取。

差异性分析表明2、4、5、6、7、10号丹参的二氢丹参酮Ⅰ含量有显著性差异，1、2、3、4、5、7、8、9号丹参的隐丹参酮和迷迭香酸含量有显著性差异，1、3、4、5、6、8、9、10号丹参的丹参酮Ⅰ含量有显著性差异，10种丹参的丹参酮ⅡA含量均有显著性差异，1、3、4、5、6、7、9、10号丹参的紫草酸含量有显著性差异，2、3、4、5、6、7、8、10号丹参的丹酚酸B含量有显著性差异。

图4 丹参脂溶性成分含量组成Fig.4 The composition of the fat-soluble components of different S.miltiorrhiza strains

图5 丹参水溶性成分含量组成Fig.5 The composition of the water-soluble components of different S.miltiorrhiza strains

对所测定的4种丹参脂溶性和3种水溶性成分进行分析，发现丹参水溶性成分中丹酚酸B占三者之和的百分比为82.5% ～89.54%，从含量上可以体现药典以丹酚酸B作为水溶性成分进行质控的合理性(图4)；所测脂溶性成分中，丹参酮ⅡA占四者之和的百分比为27.68%～42.48%，隐丹参酮占四者之和的百分比为32.72%～44.96%(图5)。可见在所测10种丹参株系，丹参酮ⅡA在含量上并无绝对优势。王立萍等[8]对山东省内不同地区的丹参进行了脂溶性有效成分的含量测定，结果发现不同产地丹参隐参酮含量差异较大，其中济南鸡山产丹参隐丹参酮含量较高，本研究实验材料均为济南产丹参，故推测出现隐丹参酮含量和丹参酮ⅡA含量都占优势的结果可能与产地有关。

2.4 相关性分析

研究表明，水溶性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B呈显著正相关，脂溶性成分中除丹参酮ⅡA和二氢丹参酮Ⅰ之间相关性不明显之外，其他脂溶性成分呈显著正相关(表6)。水溶性和脂溶性成分之间并无显著相关性，但通过数据可以看出，两者多数为负相关，猜测两大类成分在合成过程中用到的关键酶的合成以及酶催化等存在能量竞争，导致一大类成分偏高时另一类成分会相对偏低。

表6 丹参主要成分相关性分析Table 6 Correlation analysis of main components of different S.miltiorrhiza strains

注：**和*分别代表0.01和0.5水平的显著相关。

3 讨论

近年来，随着丹参主要化学成分及药理作用的研究逐步深入和心脑血管疾病患者的增多，丹参资源的开发和利用也随之逐年加大,使得丹参市场需求量不断扩大，加之以丹参为主的复方制剂及保健品的开发，使得丹参的市场需求每年可达上万吨[9-12]。目前，栽培品为药材丹参的主要来源。由于以农户为单位的种植模式多分散，规模化程度较低，种植过程中只种不选，长期的无性繁殖导致种性退化，加之丹参本身异花授粉的特性，造成了栽培丹参品种混杂，药材质量参差不齐，严重影响临床用药。优良品种的选育、推广与生产可保证丹参药材质量，提高产量、抗性等。本研究材料取自前期研究中发现的10种外观性状差异较大的丹参株系，在本文中对其外观性状进行了更为系统的统计分析，确定其在芽色，叶色，花色及植株大小等方面存在差异，以开展后续实验，为良种选育提供材料。通过对10种株系丹参进行含量测定，发现研究材料在其主要脂溶性和水溶性成分上存在显著差异。有些材料在脂溶性成分含量上占优势，有些则在水溶性成分上占优势，据此可考虑将其作为某一类活性成分的提取原料加以开发利用。在之后的选育过程中，可进一步跟进性状和化学成分稳定性的测定，另据某些成分与产地相关性的推测，可开展验证性的工作。