HPLC-DAD法测定西藏产区金银花花蕾及叶中化学成分含量

刘倩，张敏敏，李圣波，梁琰,3，刘伟，程素盼,4，王晓，耿岩玲，赵恒强*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014；2.青海亚特生物科技有限公司，青海 西宁 810000；3.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 27101834.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬(LonicrajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花，为药食兼用型植物。其性寒味甘，归肺、心、胃经，属清热解毒、疏散风热之要药[1-3]。作为常用中药，金银花在我国流通及使用的品种复杂多样。“亚特一号”良种金银花，为山东亚特生态技术有限公司以我国立本大叶金银花中产生的自然优良系株为基本，与美国优良品系金银花进行杂交，再经无性繁殖等方法；栽种、培育而成的系列新品种。该品种具有抗逆性强、耐旱、耐涝、耐寒热、耐土壤瘠薄，抗病性强，易繁殖，根系发达等优势，有非常高的药用及经济价值[4-7]。本实验研究对象即为在西藏产区种植的“亚特一号”良种金银花。现代药理学研究表明，金银花中含有有机酸、黄酮、环烯醚萜苷等复杂的化学成分，具有抗菌、抗病毒、增强免疫力、利尿和降低胆固醇等作用[8-12]。2015版《中国药典》[13]中仅以绿原酸和木犀草苷两个指标对金银花进行质量控制，具有较大的局限性。高效液相色谱技术结合标准品指认方法，能够对中药中复杂的化学成分进行初步分析、鉴定[14-17]。因此，本研究采用高效液相色谱-二极管阵列检测器技术(HPLC-DAD)对西藏产区的8批“亚特一号”良种金银花花蕾和叶中的8种主要成分绿原酸、木犀草苷、隐绿原酸、异绿原酸、马钱酸、马钱苷、断氧化马钱苷、芦丁进行分析和含量测定，并与道地产区——山东产金银花进行对比。该研究为快速了解西藏产区“亚特一号”良种金银花的化学成分含量和其后续临床应用提供了方法指导和数据支持。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

ACCHROM 6000高效液相色谱仪(北京华谱科仪科技有限公司)；BSA万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 实验材料

实验所需样品均为西藏产区拉萨市采摘的“亚特一号”良种金银花，其中包含8批金银花花蕾和8批叶样品，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的花和叶。对照品绿原酸(批号：Y24J7K16726)、异绿原酸C(批号：MUST-14111414)、隐绿原酸(批号：MUST-15011413)、木犀草苷(批号：MUST-15012204)、芦丁(批号：Y22S6S3719)、马钱酸(批号：MUST-15012207)、马钱苷(批号：R23D7F27552)、断氧化马钱苷(批号：Y21D7B30456)均购于上海源叶生物科技有限公司(纯度均大于98%)。乙腈、乙酸为色谱纯(美国Tedia公司)，实验用水为Milli-Q 超纯水(18 MΩ)，其他试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

将金银花药材粉碎，过4号筛。精密称取金银花药材粉末0.2 g，甲醇溶液10 mL，40 ℃水浴加热提取10 min，后加入纯水5 mL，超声(功率250 W，频率20 kHz)30 min复提，用70%甲醇水溶液补足减失的质量，提取液过0.22 μm有机滤膜，即得供试品溶液。

2.2 标准品溶液的制备

精密称取马钱酸(1)、绿原酸(2)、隐绿原酸(3)、马钱苷(4)、断氧化马钱苷(5)、芦丁(6)、木犀草苷(7)、异绿原酸C(8)对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为1.0 mg/mL的对照品溶液，其中木犀草苷(70%甲醇)配制为0.5 mg/mL 的对照品溶液，4 ℃避光保存备用。

2.3 色谱条件

ACCHROM 6000高效液相色谱仪(北京华谱科仪科技有限公司)，Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱。流动相A为乙腈，流动相B为水(0.2%甲酸)，梯度洗脱：0～10 min，8%～10% A；10%～20 min，10～15% A；20～30 min，15%～15% A；30～40 min，15%～25% A；40～50 min，25%～30% A，50～51 min，30%～100% A；51～60 min，100%～100% A；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。

2.4 HPLC方法学考察

2.4.1 线性关系考察

将木犀草苷、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸、马钱酸、马钱苷、断氧化马钱苷、芦丁8种对照品溶液分别稀释，得到不同浓度的对照品混合溶液，按照2.3项下色谱条件进样分析，得到8种对照品的液相色谱图，见图1。以峰面积积分值(y)对质量浓度(x)进行回归计算，各化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限、定量限见表1。

表1 样品回归方程、检出限和定量限Table1 Regression equations、detection limit and quantitative limit of samples

图1 “亚特一号”金银花蕾、叶提取物及8种对照品的HPLC色谱图(254 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of extracts of flower buds and leaves of Lonicera japonica “AT1” and 8 kinds of control products(254 nm)

2.4.2 精密度实验

取供试品溶液(批号为金银花蕾1)连续重复进样6次，测得其中8个特征峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差(RSD)，其特征峰保留时间RSD依次为0.9%、0.9%、0.9%、0.7%、0.6%、0.9%、0.4%、0.2%，均小于1.0%，峰面积RSD依次为3.1%、0.6%、3.7%、3.6%、0.8%、2.7%、0.8%、2.0%，均小于5.0%，结果符合实验技术要求，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

取供试品溶液(批号为金银花蕾1)，按照2.3项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录色谱图。结果表明，8个特征峰保留时间RSD依次为1.1%、0.9%、0.9%、0.8%、0.6%、1.0%、1.5%、1.2%，峰面积RSD依次为4.8%、0.5%、4.8%、3.3%、0.8%、2.9%、1.8%、1.9%，均小于5%，表明样品溶液在室温条件下24 h内化学稳定性良好，符合实验技术要求。

2.4.4 重复性实验

取供试品(批号为金银花蕾1)6份，按2.1项下处理方法制成供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进样测定，测得8个特征峰的峰面积和保留时间，并计算其RSD。结果表明，8个特征峰保留时间RSD分别为1.0%、1.0%、1.0%、0.7%、0.6%、1.0%、0.5%、0.2%，峰面积RSD分别为4.7%、0.9%、4.1%、3.4%、0.8%、2.9%、0.7%、2.4%，均小于5.0%，结果表明方法重复性良好，符合实验技术要求。

2.4.5 加标回收率

精密称取取供试品溶液(批号为金银花蕾1)样品6份，每份0.2 g，分别按照样品中8种指标成分含量80%、100%、120%共3个水平，加入对照品溶液，按2.1项下处理方法制成供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进样测定。马钱酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、断氧化马钱苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸C的平均回收率分别为93.32%、94.15%、91.52%、91.01%、92.17%、104.33%、92.52%、95.67%；RSD分别为2.35%、3.20%、4.17%、3.02%、3.09%、3.98%、3.47%、2.36%。

2.4.6 含量测定

分别取8批亚特一号金银花蕾和叶，采用2.1供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用2.3色谱条件分别进样分析，得出上述8种化合物的相应峰面积，根据2.4.1方法中回归方程算出各化合物的含量，平行3次取平均值，结果见表2。

表2 8批金银花蕾和叶的含量测定结果(n=3)Table 2 Content determination results of 8 batches of flower buds and leaves of Lonicera japonica μg·g-1

续表2

马钱酸绿原酸隐绿原酸马钱苷断氧化马钱苷芦丁木犀草苷异绿原酸C金银花叶74 581.241 793.51 068.6719.22 750.82 164.99 106.3488.7金银花叶83 599.432 182.3736.5605.22 130.51 887.76 913.7402.7金银花叶平均值3 952.435 844.7833.4686.72 412.51 793.87 901.9456.7

3 讨论

3.1 提取条件优化

超声提取法具有快速、简便等优点，而水浴加热提取法具有耗时短、提取率高等特点，本研究采用水浴加热提取法结合超声提取法来用于金银花和金银花叶中成分的提取，同时考察了提取溶剂、提取时间等因素对提取效率的影响。

考虑到金银花中含有的化合物种类繁多，极性差别较大，故选择先采用纯甲醇作为提取溶剂水浴加热，提取其中含有的极性较低的化合物；再加入纯水，超声提取其中高极性的化合物。综合比较分析，通过增加水在提取溶剂中的比例，可以得到较多的色谱峰，故本实验选择先采用10 mL纯甲醇水浴加热，再加入5 mL纯水超声提取。水浴提取时，采用10 min和20 min提取无明显差别，故选择水浴加热10 min作为第一次提取时间；加入5 mL纯水，分别超声提取15 min、30 min和45 min，结果显示30 min和45 min提取效率高于15 min，但采用30 min和45 min提取无明显差别，故选择时间较短的30 min作为第二次提取时间。

3.2 HPLC条件优化

金银花提取物中化学成分复杂多样，化合物极性差别较大，故采用洗脱范围较广的乙腈-水作为流动相对金银花提取物进行洗脱。另外，本实验考察比较了Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱以及SymmetryC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱共3个不同类型C18柱对金银花提取物的分离效果，结果发现，采用Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱时分离度较好、色谱峰较多。因此，选用该柱对提取物进行色谱分离分析。由于金银花中有机酸类含量较高，色谱峰容易产生拖尾现象，故考虑通过在流动相中加入少量的酸来改善分离度及峰型。考察了在水相中分别加入0.1%、0.2%、0.4%甲酸、0.2%和0.4%乙酸，对金银花提取物色谱分离的影响，结果发现在水相中加入0.2%甲酸时色谱峰对称性较好、峰型较好，因此，选择乙腈-0.2%甲酸作为流动相。在波长选择上，经二极管阵列检测器考察金银花提取物中各类成分在190～400 nm波长下的紫外吸收效果，结果发现在254 nm下金银花中各成分均有吸收且有较好的分离度，因此，选择254 nm作为金银花提取物的检测波长。同时考察得出柱温25 ℃时，色谱峰分离度和峰型较好，因此选择在此柱温下进行分析。

3.3 金银花中活性成分含量的对比

从表2中的数据可以看出，西藏产区金银花花蕾中绿原酸的含量最高，平均含量为3.85%，断氧化马钱苷的含量最低；在金银花叶中，绿原酸含量最高，平均含量为3.58%，异绿原酸C的含量最低。综合金银花蕾和叶的数据，发现在绿原酸、隐绿原酸、马钱苷和异绿原酸C的含量分布中，金银花蕾高于金银花叶；而马钱酸、断氧化马钱苷、芦丁和木犀草苷4种成分含量在金银花叶中分布高于金银花蕾。

与金银花道地产区山东所产的10批金银花样品进行对比，结果发现西藏产区“亚特一号”良种金银花的绿原酸平均含量(3.85%)远高于山东产区(1.62%)，而木犀草苷、异绿原酸C和马钱酸的平均含量均略高于山东产区，芦丁的平均含量则低于山东产区[18]，见图2；与不同产地来源、品种的金银花相比较，发现包含道地产区山东在内的如河南、陕西、重庆、河北等13个金银花样品中绿原酸和木犀草苷的含量分别在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范围内[19-21]，而本研究中西藏产区“亚特一号”良种金银花的绿原酸含量为3.36%～4.45%，木犀草苷含量为0.12%～0.17%，结果表明西藏产区“亚特一号”良种金银花中的绿原酸含量明显高于一般品种的金银花，木犀草苷含量也略高于多数品种的金银花。

图2 西藏金银花和山东金银花的活成分含量对比Fig.2 Comparison of active ingredient contentbetween Lonicera japonica in Tibet and that in Shandong

4 结论

本研究采用高效液相色谱-二极管阵列检测器技术(HPLC-DAD)，对西藏产区的8批“亚特一号”良种金银花花蕾和叶进行了分析，并采用多指标定量对其进行质量评价，得到的含量数据与其他产地、品种的金银花进行了对比。研究结果为西藏产区“亚特一号”良种金银花的进一步开发、利用提供方法和数据支持。