雷帕霉素对动脉粥样硬化小鼠斑块面积影响及机制探讨*

王青龙，姜希娟，范英昌，庞晓丽

（1.天津中医药大学研究生院，天津 300193；2.天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193；3.天津中医药大学护理学院，天津 300193）

动脉粥样硬化（AS）是冠心病、脑梗死、外周血管疾病的主要原因。研究显示炎症反应可以促进粥样斑块进行性发展，继而破裂出血引发急性心脑血管事件[1]。因此，控制炎症反应可抑制斑块的发生发展。近年来，很多学者认为AS属于慢性免疫－炎症反应[2－3]，从免疫角度探讨AS发生发展中的炎症反应机制成为目前研究的热点之一。雷帕霉素作为一种免疫抑制剂，在抗AS方面的研究已经取得了一些进展[4－5]。然而，其具体作用机制尚未完全阐明。故实验通过建立小鼠动脉粥样硬化模型，探讨雷帕霉素对粥样斑块面积的影响及机制，以期为临床研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 药物准备 根据说明书，基于体表面积换算人鼠等剂量，并将药物溶入适量生理盐水中。

1.2 实验动物与分组 选取健康ApoE基因敲除（ApoE－/－）雄性小鼠 30 只，体质量 25～30 g，6～8 周龄（国家卫生研究院提供）。动物适应性喂养2周后，采用随机数字表法将小鼠分为3组：模型组10只、雷帕霉素组（RAPA）10只，阳性药物（瑞伐他汀）组10只，另饲养C57小鼠10只作为空白对照组。空白对照组给予正常饮食，其他3组均给予高脂饮食12周。12周后，RAPA组和阳性药物组给予相应剂量药物灌胃4周，模型组与空白对照组给予等剂量生理盐水灌胃4周。4周后处死取材。

1.3 观察方法与指标 1）处死小鼠后取主动脉窦斑块，冰冻连续切片后油红O染色，观察各组斑块内脂质情况。2）取主动脉窦及主动脉弓斑块，石蜡连续切片后苏木精－伊红（HE）染色,利用图像分析仪评估斑块面积。3）取小鼠外周血，离心后取上清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定外周血中肿瘤坏死因子 α（TNF－α）、γ 干扰素（INF－γ）、白介素－6（IL－6）、白介素－10（IL－10）、转化因子 β（TGF－β）含量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件包进行分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法行配对t检验，以P＜0.05定为有统计学差异。

2 结果

2.1 油红O染色 模型组、雷帕霉素组及阳性药物组均形成动脉粥样硬化斑块，其中模型组形成的粥样斑块具有较大脂核，见图1。

图1 各组斑块主动脉窦油红O染色（×40）Fig.1 Aortic sinus imaging of Oil red staining among groups（×40）

图2 各组斑块主动脉弓HE染色（×40）Fig.2 Aortic arch imaging of Hematoxylin and eosin among groups（×40）

2.2 斑块面积 基于HE染色利用图像分析仪计算各组斑块面积及占管腔的百分比。结果显示，与模型组比较，雷帕霉素组斑块面积及狭窄程度明显小于模型组，有统计学意义（P＜0.05）；瑞伐他汀组虽然斑块面积与模型组比较无统计学意义（P＞0.05），但在狭窄程度方面有统计学意义（P＜0.05），见表1。雷帕霉素组与瑞伐他汀组比较，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

表1 各组斑块面积及占管腔面积百分比比较（±s）Tab.1 Comparison of the plaque area and lumens area account among groups（±s）

表1 各组斑块面积及占管腔面积百分比比较（±s）Tab.1 Comparison of the plaque area and lumens area account among groups（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别模型组RAPA组瑞发他汀组动物数10 10 10斑块面积（mm2） 斑块面积百分比（%）651.30±145.81 0.384±0.500 502.32±184.75* 0.297±0.600**625.82±170.46 0.339±0.400*

2.3 外周血中 TNF－α、INF－γ、IL－6、IL－10、TGF－β含量 结果显示，模型组与空白对照组比较，促炎因子明显升高，而抗炎因子明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；雷帕霉素组与模型组比较能有效降低促炎因子含量，增加抗炎因子表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；瑞伐他汀组与模型组比较除IL－10外，差异均匀统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

3 讨论

近年来很多学者认为AS属于慢性免疫－炎症性疾病，斑块内大量巨噬细胞、淋巴细胞（主要为CD4+T细胞）、炎症因子聚集引发免疫炎症反应，可导致斑块进行性发展[6－7]。研究显示，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激活后可促进巨噬细胞增殖、迁移及CD4+T淋巴细胞向效应性T细胞分化，进而导致AS炎症反应放大[5，8]。因此，调控mTOR通路可抑制免疫炎症反应，进而抑制AS斑块进展。

表2 各组外周血中炎症因子含量测定比较(x±s)Tab.2 Comparison of inflammatory factors in peripheral blood among groups(±s)pg/mL

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白对照组模型组RAPA组瑞伐他汀组动物数10 10 10 10 TNF－α INF－γ IL－6 IL－10 TGF－β 1 237.19±331.84 1 112.14±399.52 1 341.82±336.34 553.23±126.18 976.89±161.77 2 438.26±920.70* 1 778.02±177.12* 1 963.73±387.36* 411.43± 20.98* 484.52±152.52**1 054.38±273.69# 1 055.50±108.16## 1 541.07±107.77# 481.26± 38.21# 1 031.66±193.83##1 065.59±347.33# 1 208.98± 61.40# 1 446.71±268.97# 476.90± 68.11 1 104.39±294.54##

雷帕霉素为免疫抑制剂，可通过抑制mTOR通路达到控制免疫反应的作用[4]。本研究油红O及HE染色显示，雷帕霉素组斑块脂核明显小于模型组。基于HE染色图像分析结果证明，该药可有效减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块面积，降低血管狭窄程度，与临床治疗AS阳性药物－他汀类效果相同。说明一方面，AS进展过程中确实存在免疫反应；另一方面，这种免疫反应与mTOR通路关系密切。

在免疫引发的炎症反应方面，研究表明mTOR通路激活后，一方面可促进巨噬细胞增殖，增殖的巨噬细胞会释放大量炎症因子如TNF－α、INF－γ、IL－6 等，加剧 AS 炎症反应[6，9]。另一方面，可促进CD4+T亚群细胞向效应性T细胞分化，降低调节性T细胞（Treg）数量，进而导致Treg细胞分泌的抗炎因子 IL－10、TGF－β 表达降低，炎症反应放大[10－11]。本研究结果显示，雷帕霉素可有效降低动脉粥样硬化小鼠外周血中 TNF－α、INF－γ、IL－6 含量，增加 IL－10、TGF－β含量。因此，推测这可能与该药抑制巨噬细胞增殖、增加Treg细胞数量有关。综上所述，雷帕霉素可通过增加抗炎因子含量、降低促炎因子含量来调控炎症反应，进而抑制斑块发展，降低血管狭窄程度。

总之，雷帕霉素为抗真菌感染、抗移植免疫反应药物，在治疗AS方面的研究尚处于起步阶段。本研究从炎症角度探讨该药对AS的作用机制，但在免疫炎症具体作用靶点方面还需进一步研究。