天津地区引种丹参的研究*

邢桉荣 ，常广璐 ，王志强 ，何燕峰 ，曹丽娟 ，李天祥

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津天士力中药科技发展有限公司，天津 300410；3.天津盛实百草药业有限公司，天津 300301）

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，迄今已有2 000多年临床应用历史，是临床常用大宗药材之一[1]。自20世纪60年代开始，各地对丹参进行广泛引种栽培[2]。但在丹参人工栽培过程中，种质混杂、栽培技术不规范，影响了丹参的品质和临床疗效[3]。因此，选择适宜的丹参种植基地以及品种优良的丹参种源，规范丹参栽培、采收技术，合理轮作、防治病虫害成为提高丹参产量与质量的研究重点。

前期项目对天津野生中药资源进行调查发现，天津蓟县北部山区有野生丹参分布，并初步进行评价：药材品质较佳，活性成分含量较高，其中丹参酮类成分含量高达0.908%，是《中国药典》2015版限量标准的3.6倍。因此，在天津地区引种丹参具备一定的可行性。自2013年起，本研究从河南、山东、陕西、河北、安徽等丹参的国内主产区或道地产区引进丹参种苗，分别在天津蓟州区、武清区、静海区引种同一种源地丹参种苗；于天津静海区引种不同种源地的丹参种苗，进行综合评价。对引种后丹参的药材干重、有效成分含量、重金属及有害元素含量等质控指标进行系统分析，探索在天津地区引种丹参的可行性，并为进一步寻找丹参新的培育基地提供科学的数据支撑。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 Alltech 1500系列Q05型高效液相色谱仪（美国Alltech科技有限公司）；UV-6100紫外可见分光光度计（上海美普达有限公司）；iCE 3500原子吸收光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；AF-610A原子荧光光谱仪（北京瑞利分析仪器公司）；EH35A plus电加热板（美国Lab-Tech公司）；FA 2104电子天平（200 g，上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；SB25-12DT超声波清洗机（功率140 W，频率42 kHz，宁波新芝生物科技股份有限公司）；DFZ-6050型真空干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；元素空心阴极灯（北京曙光明电子光源仪器有限公司）。

1.2 试剂 硝酸、高氯酸为优级纯；丹参酮IIA对照品（批号MUST-14060802）、丹酚酸B对照品（批号MUST-13103113）、芦丁对照品（批号 MUST-12040302）购于成都曼斯特；甲醇（天津市康科德科技有限公司）、乙腈（天津市福晨化学品有限公司）为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂为分析纯；单元素Cu、Cd、Pb标准溶液，离子浓度为1000μg/mL，As、Hg 标准溶液，离子浓度为 100 μg/mL，均购于天津傲然精细化工研究所；GBW 07603－生物成分分析灌木枝叶成分分析标准物质，购于中国地质科学院地球物理地球化学勘察研究所。

1.3 材料 实验地栽培丹参种苗分别购于山东日照、陕西商洛、安徽亳州、河南方城、河南信阳大别山区，此外“天丹一号”种苗由天津天士力中药资源科技发展有限公司提供，航空育种苗由天津市农业科学院植物保护研究所提供。种苗经天津中医药大学李天祥教授鉴定为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的幼苗。

1.4 实验田基本信息 实验区为天津地区，本区处于温带大陆性季风气候区，年平均降水量520～600mm，日照时数1 450～1 700 h，年均温11℃～13℃，无霜期200～250 d。土壤状况见表1。

2 方法

2.1 丹参酮ⅡA、丹酚酸B的测定

2.1.1 对照品储备液的制备 取丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品适量，精密称定，分别置棕色容量瓶中，加甲醇配置成含丹参酮ⅡA、丹酚酸B各0.654mg/mL、1.120 mg/mL的对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 丹参酮类成分 精密称取本品粉末（过三号筛）0.300 0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理60 min，放冷，甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。丹酚酸B：精密取本品粉末（过三号筛）0.1500g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，80%甲醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 丹参酮类成分Agilent Eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）－0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱：0～2 min，61%A；2～10 min，61%～90%A；10～10.5 min，90%～61%A；10.5～20 min，61%A；体积流量 0.9 mL/min；柱温为室温；进样量10 μL；检测波长270 nm。

丹酚酸BAgilent Eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B）（22∶78）；体积流量 1.2 mL/min；柱温为室温；进样量10 μL；检测波长286 nm。见图1。

2.2 总黄酮、总酚酸含量的测定

2.2.1 对照品储备液的制备 分别取芦丁、丹酚酸B对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加水分别配置成含芦丁1.370 mg/mL，含丹酚酸B 1.100 mg/mL的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 丹参酮类成分 样品精密称定后，置100 mL具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，70℃加热回流1 h，放冷，70%乙醇补重，摇匀，滤过，取上清液，即得。

丹酚酸B样品精密称定后，置100mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声40 min，放冷，甲醇补重，摇匀，滤过，取上清液，即得。

2.2.3 显色方法及测定方法 总黄酮UV－VIS法测定丹参中总黄酮的含量。精密移取供试品溶液1.0 mL至10 mL刻度管中，加水至2 mL，加10%NaNO21.5 mL及10%Al（NO3）30.5 mL，暗处放置5 min，加5 mol/L NaOH 4 mL显色，定容至刻度，暗处反应10 min，以显色剂为空白，波长495 nm测定吸光度。

总酚酸 UV－VIS法测定丹参中总酚酸的含量。精密移取供试品溶液1.0 mL至10 mL刻度管中，加水至2 mL，加10%NaNO22.0 mL及10%Al（NO3）30.75 mL，暗处放置 5 min，加 5 mol/L NaOH 4 mL显色，定容至刻度，暗处反应10 min，以显色剂为空白，波长510 nm测定吸光度。

表1 实验田土壤状况等基本信息Tab.1 Basic information of experimental plots

图1 对照品（A、B）和丹参样品（C、D）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard compounds(A、B)and Salviasample(C、D)

2.3 无机元素含量测定 精密称取0.5g试样（60目）于50 mL聚四氟乙烯烧杯中，加入10 mL混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1，体积比），盖上表面皿，置于通风橱内预消解。次日于100℃电热板上消解2 h，补加硝酸3 mL，然后120℃、140℃各消解2 h，用3 mL硝酸冲洗表面皿，经常摇动烧杯，赶酸至白烟冒尽，定容至50 mL，其中1%硝酸定容用于原子吸收分光光度法（FAAS）测定Cu元素的含量，石墨炉原子吸收分光光度法（GFAAS）测定Cd、Pb元素的含量；5%盐酸定容用于原子荧光光度法（AFS）测定As、Hg元素的含量。每批样品同时消解灌木枝叶分析标准物质并制备全程序空白溶液，所有样品均采用平行双样。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芦丁、无机元素对照品溶液，分别加水稀释成适宜浓度，注入高效液相、原子吸收、原子荧光或紫外可见分光光度计，测定其峰面积或吸光度。以峰面积或吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线，结果见表2。

2.4.2 精密度实验 精密吸取各对照品溶液适量，按色谱条件重复6次，测定各峰面积或吸光度，得RSD值，按表3顺序分别为0.83%、0.65%、0.98%、0.55%、0.33%、0.26%、0.36%、1.20%、2.53%。

表2 丹参指标成分及无机元素的回归方程及线性范围Tab.2 regression equation and linear range of index components and inorganic elements of Salvia miltiorrhiza

2.4.3 重复性实验 精密称定样品6份，配制各供试品溶液，进样，分别测定其峰面积或吸光度，得RSD值，按表3顺序分别为1.49%、2.47%、2.75%、2.16%、0.86%、3.39%、1.54%、2.06%、1.02%。

2.4.4 稳定性实验 精密吸取各对照品溶液，每隔2 h（丹参酮 IIA，丹酚酸 B）、20 min（总黄酮，总酚酸）进样，分别测定其峰面积或吸光度，得RSD值分别为2.26%、0.86%、1.69%、0.64%，表明其在一定时间内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率实验 精密称定样品6份，分别加入对照品适量，按各供试品溶液项下制备，测定其峰面积或吸光度，计算各加样回收率，按表3顺序分别为 103.78%、98.77%、104.53%、103.77%、0.48%、1.45%、1.36%、2.65%、2.58%。

2.5 样品测定 大田取样方法，采用样方法取样，每个品种取样10份，每个样品重复取样10次。

3 结果

3.1 天津地区引种丹参的可行性

3.1.1 质量指标的测定 《中国药典》（2015年版）规定丹参药材中丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮三者之和不得少于0.25%，丹酚酸B含量不得少于3.0%[4]。蓟县区、静海区、北辰区引种山东丹参种苗后，其药材中丹参酮类、总黄酮、丹酚酸B及总酚酸含量均满足药典标准，以北辰区产最大，分别为4.97、41.18、51.85、63.96 mg/g；静海区产次之，分别为3.30、28.03、49.77、53.59 mg/g；蓟县区产最低，分别为 3.01、26.20、42.81、42.95 mg/g，各产地两两比较均有极显著差异。干重以静海区（128.86 g/株）最大，蓟县区（106.80 g/株）次之，北辰区（54.68 g/株）最低。比较北辰区与蓟州区、静海区土壤质地差异发现，蓟州区、静海区为黏质土，北辰区为砂质土；北辰区土壤中的有机质含量、CEC值、水解氮含量、速效磷含量均低于蓟州区与静海区。分析原因，可能是砂质土中营养成分缺乏的胁迫作用有利于丹参二次代谢产物的累积，黏质土中丰富的营养成分则有利于丹参产量的增长。

3.1.2 重金属元素及有害元素含量的测定 各地区引种丹参后药材中 Pb、Cd、As、Hg、Cu 含量分别为：蓟县区为 0.705、0.046、0.341、0.074、13.005mg/kg；静海区为 0.444、0.031、0.712、0.005、14.589 mg/kg；北辰区为 0.792、0.035、0.070、0.078、16.392 mg/kg。均低于药代限量标准。

由上考察结果可知：天津地区引种丹参指标成分含量均达到药典限量标准，且重金属及有害元素含量均低于药典限量标准；综合考虑引种丹参干质量、指标成分含量等因素，静海区引种丹参质量较优：单株干质量达128.86，丹参酮类成分含量达0.33%，丹酚酸B含量达4.98%。因此，天津静海区可作为丹参新的栽培基地较为合理。

3.2 不同产地丹参种苗引种天津后的质量

3.2.1 产量及不同种源指标结果 陕西商洛种源丹参引种后丹参酮类含量为0.183%，天丹1号、河南大别山、河南方城种源丹参引种后丹酚酸B含量分别为2.542%、2.415%、2.583%，均低于药典标准，质量不合格。山东日照、航空育种、安徽亳州种源丹参引种后质量合格，药材干质量、丹参酮类、总黄酮、丹酚酸B及总酚酸含量分别为：山东日照为128.86 g/株、3.30、28.03、49.77、53.59 mg/g；航空育种为 76.16g/株、2.67、17.23、37.35、43.89 mg/g；安徽亳州为 60.58 g/株、2.68、29.91、48.61、52.28 mg/g。其中，药材干重以及丹参酮类、丹酚酸、总酚酸含量均以山东日照种源引种后药材最高，总黄酮含量虽低于安徽亳州种源引种后药材，但无显著性差异。因此，可认为种源地为山东日照丹参种苗引种天津栽培后的质量较优。

3.2.2 重金属及有害元素含量测定结果 重金属及有害元素含量测定结果 对质量合格品药材进行元素测定，其 Pb、Cd、As、Hg、Cu 含量分别为：山东日照为 0.444、0.031、0.712、0.005、14.589 mg/kg；航空育种为 0.579、0.033、0.293、0.152、11.613 mg/kg；安徽亳州为 0.529、0.026、0.439、0、13.410 mg/kg。均符合药典限量标准。

4 讨论

天津地区气候干旱较严重，年平均降水量为571 mm，日数 64～73 d，降雨时间集中在 7～8 月；降雨区域主要集中在东部沿海与北部山区[5]。同时，天津地区土质具有盐渍化特点，尤其是滨海区。独特的土壤及气候特点，对天津引种丹参的品质形成和产量，拓展了新的研究空间。静海区土壤为盐化潮质土、中黏土，引种后的丹参干质量最大，亩产量高，有效成分含量仅次于北辰区，但药材干质量为北辰区的2.32倍。分析原因，可能与不同土壤质地中，营养成分的含量以及干旱的胁迫作用有关。一般黏质土中有机质、水解氮、速效氮的含量一般高于砂质土，有利于丹参生长，药材干质量较高，产量较大。黄璐琦[6]等提出，环境胁迫可能会刺激植物代谢产物的累积，砂质土对于丹参生长具有一定的干旱胁迫作用，有利于药材中酚酸类成分的产生。可见，北辰区砂质土所栽培丹参中有效成分含量高是合理的。

天津静海主要为盐渍化土质，盐碱化程度较高，矿物质养分较充足（CEC值高）。由于地下水位高，泛碱、泛盐时常发生。上述不利的土质状况相反会极大促进、提高土壤表土与底土的养分交换能力，使表土肥力常新，结果能及时纠正中药材种植连作障碍造成养分供给失衡。这是其他丹参道地产区土壤不具备的特点。因此，可以推测，静海盐渍化土质这些潜在优势，可能减轻或缓解丹参连作重茬问题。

不同产地丹参种苗引种天津静海区后，以山东日照种源栽培丹参质量最优。山东、山西、陕西、河南、河北、湖北、四川、安徽都曾被视为丹参的道地产区或主产区。张兴国等[7]通过对大田生产丹参进行调查，发现丹参有白花、紫花、皱叶、小叶、高茎、矮茎等多种种质类型，可见，目前丹参种质品系不纯现象比较严重；此外，由于长期采用无性繁殖，种质退化也较严重；不同产地交互引种，品种混乱，导致商品质量和产量极不稳定[8]。因此，对道地产区丹参优良种质进行纯化，在适宜环境下开展引种系统研究、质量评价，寻找新产地，扩大种植面积，为市场提供丰富的药材资源，以解决临床用药供需矛盾。

5 结论

山东日照丹参种苗引种天津蓟州区、北辰区、静海区后，栽培品指标成分均满足药典标准，重金属及有害元素含量低于药典限定标准，且以静海区引种丹参品质较优。丹参酮类以及丹酚酸B含量分别为药典标准的1.32、1.66倍，适宜作为天津地区引种丹参种源。