银杏二萜内酯葡胺注射液对离体心脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

李延珍

（邯郸市第一医院，邯郸 056002）

心脏缺血再灌注损伤是急性心肌梗死溶栓后以及多种心脏手术术后常见并发症，严重影响患者预后，是临床上亟待解决的难题。银杏二萜内酯葡胺注射液（DGMI）主要成分为银杏内酯，其中银杏内酯A占35%、银杏内酯B占60%、银杏内酯C占2%、银杏内酯K占2%，DGMI能够通过修复血脑屏障、调节脑内氨基酸类和单胺类神经递质的水平、改善脑组织血液循环、抑制氧化应激损伤等而对脑组织缺血性疾病具有一定的治疗作用[1－3]，但DGMI对心肌缺血再灌注损伤是否能够起到一定的保护作用的文献报道尚不多见。本实验采用Langendorff灌流系统，建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型，以维拉帕米为阳性对照药物，研究DGMI对离体心脏的保护作用并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠（8周龄，220～260 g）购自河北省实验动物中心[SCXK（冀）2013－1－003]。饲养环境：23～25 ℃、相对湿度 55%～60%，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试验药物与试剂 DGMI购自江苏康缘药业股份有限公司（规格：25 mg∶5 mL，批号：20170416）；维拉帕米注射液购自上海禾丰制药有限公司（批号：43170116）；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）购自美国Sigma公司（批号：M2128）；苏木精－伊红（HE）试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：161029）；谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸肌酸同工酶（CK－MB）试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司（批号：170101018、161209011、170117008）；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、Na+－ATP、Ca2+－ATP 试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：161207、161124、160916、170118、160910）；K－H 液：用 NaCl 20.67 g、NaHCO 36.27g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、葡萄糖 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g 溶解于1 L蒸馏水，调节pH＝7.40（自制）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、给药与造模 将100只实验用大鼠根据体质量随机分为正常对照组，模型组，DGMI低（1.5 mg/kg）、中（3 mg/kg）、高（6 mg/kg）剂量组和维拉帕米2.5 mg/kg组（阳性药物对照组），其中DGMI中剂量组相当于人临床常规剂量，各组均20只；手术前2 h，DGMI各剂量组和维拉帕米2.5 mg/kg组分别腹腔注射给予相应药物，正常对照组和模型组均给予生理盐水。参照郭丽丽等[4]报道的实验方法制备大鼠离体心脏缺血再灌注模型：腹腔注射20%乌拉坦实施麻醉后，迅速开胸，切断主动脉后取出心脏，置预冷（4℃）K－H液中，分离主动脉，釆用Langendorff法逆灌含氧K－H液（充以95%O2+5%CO2），切开左心耳并由此置入带测压导管的球囊，测压导管连接生物信号采集系统。正常对照组持续以7 mL/min恒速平衡灌注K－H液（37℃）110 min，模型组、DGMI各剂量组和维拉帕米组依次行7mL/min恒速平衡灌注K－H液（37℃）20 min、停灌30 min后恢复灌注60 min，然后取材行各指标检测。

1.3.2 心肌酶（AST、LDH、CK－MB）活性检测 分别取各组大鼠心脏冠脉流出液，采用生化分析法检测心肌酶 AST、LDH、CK－MB 活性。

1.3.3 TTC染色法测定心脏组织梗死面积 每组随机选取6只大鼠离体心脏，－20℃冻存20 min，置于2%TTC溶液恒温（37℃）、避光孵育15 min，红色为正常组织、灰白色为梗死区，通过BI－2000医学图像分析系统（成都泰盟软件公司）计算梗死面积百分率。

1.3.4 HE染色法观察心脏组织病变 每组另随机取6只大鼠离体心脏，置4%多聚甲醛溶液固定72h，经常规脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，按照染色试剂盒操作步骤行HE染色，然后通过倒置光学显微镜观察心脏组织病变。

1.3.5 血流动力学指标检测 通过连接测压导管的生物信号采集系统记录各组大鼠离体心脏组织心率（HR）、左室舒张末压（LVEDP）、左室收缩压（LVSP）、左室收缩压最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒张压最大下降速率（－dP/dtmin）。

1.3.6 心脏组织抗氧化酶活性，MDA含量及Na+－ATP、Ca2+－ATP活性检测 取各组剩余的8只大鼠离体心脏组织，于4℃环境剪碎、加入适量冷裂解液后研磨匀浆,制备10%组织匀浆液，3 500 rpm离心10 min取上清液，按照各检测试剂盒操作方法，通过紫外－可见分光光度计检测心脏组织中抗氧化酶SOD、CAT 活性，MDA 含量以及 Na+－ATP、Ca2+－ATP活性。

1.4 统计学方法 所有实验数据均采用SPSS17.0进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD－t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌酶活性测定结果 结果如表1所示：与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶 AST、LDH、CK－MB 活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组冠脉流出液 AST、LDH、CK－MB 活性显著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 各组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶活性（±s）Tab.1 Myocardial enzyme activity of coronary effluent from isolated hearts of rats in each group（±s）

表1 各组大鼠离体心脏冠脉流出液心肌酶活性（±s）Tab.1 Myocardial enzyme activity of coronary effluent from isolated hearts of rats in each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数 AST（U/L） LDH（U/L） CK－MB（U/L）正常对照组 20 9.81± 1.98 8.56± 2.74 680.27± 75.18模型组 20 63.86±14.72**91.64±15.08**1 785.41±270.95**DGMI低剂量组 20 54.01±14.29 73.68±13.94△ 1 512.48±211.03 DGMI中剂量组 20 27.38± 5.73## 48.26±11.72## 1 090.37±186.19#DGMI高剂量组 20 15.80± 4.19## 26.30± 8.17## 986.82±171.36##维拉帕米组 20 39.69±12.54# 54.07±13.15## 1 079.63±187.42#

2.2 心肌组织梗死面积测定结果 结果如表2所示：与正常对照组比较，模型组大鼠离体心肌组织梗死面积百分率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组心肌组织梗死百分率显著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 各组大鼠离体心脏梗死面积百分率测定结果（±s）Tab.2 Percentage of isolated myocardial infarct area in each group of rats（±s）

表2 各组大鼠离体心脏梗死面积百分率测定结果（±s）Tab.2 Percentage of isolated myocardial infarct area in each group of rats（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数 梗死百分率（%）正常对照组 6 0.00±0.00模型组 6 42.37±4.51**DGMI低剂量组 6 38.46±5.29 DGMI中剂量组 6 31.81±5.30#DGMI高剂量组 6 23.05±4.08##维拉帕米组 6 31.14±4.75#

2.3 心脏组织病变观察结果 结果如图1所示：正常对照组大鼠离体心脏组织细胞形态未见异常；模型组心脏组织呈现肌原纤维断裂、间隙增宽、排列紊乱，细胞空泡变性、细胞质着色不均、胞核深染等病变；较模型组，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组离体心脏组织病变呈现不同程度改善，其中以DGMI高剂量组效果较为显著。

图1 各组大鼠离体心脏组织形态（HE×200）Fig.1 Heart tissue morphology of the rat in each group(HE×200)

2.4 血流动力学指标测定结果 结果如表3所示：与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏血流动力学指标（HR、LVSP、+dP/dtmax、－dP/dtmin）显著下降而LVEDP显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组 HR、LVDP、+dP/dtmax、－dP/dtmin显著升高且LVEDP显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量测定结果 结果如表4所示：与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏组织SOD、CAT显著降低且MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组SOD、CAT活性显著升高（P＜0.05或 P＜0.01），MDA 含量显著降低（P＜0.01）。

2.6 Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活力测定结果 结果如表5所示：与正常对照组比较，模型组大鼠离体心脏组织 Na+－ATP、Ca2+－ATPase 活力显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，DGMI中、高剂量组和维拉帕米组 Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活力显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。

3 讨论

随着高血压、高脂血症等患病人群的增多，冠心病以及由其所引发的急性心肌梗死发病率逐年升高，严重危害着人类的生命健康。目前，临床上以使冠状动脉再通、恢复血流再灌注是治疗缺血性心脏病的首选方案，但缺血再灌注损伤并发症严重影响着患者预后。近年来，郭志祥[5]和刘家袁等[6]研究发现血流动力学改变、氧化应激损伤以及ATPase活性降低是心肌缺血再灌注损伤主要病理机制，这也为研发能够有效降低缺血再灌注损伤的新型药物提供了思路。

银杏叶为银杏科银杏属多年生落叶乔木银杏的叶，是中国传统中药品种，《本草纲目》和《中药志》中均有记载，其性味甘苦涩平，具有益心敛肺、化湿止泻之功效。现代药学研究发现，银杏二萜内酯类化合物为银杏叶的主要有效成分，包括银杏内酯A、B、C、K等，既往研究发现银杏二萜内酯具有多种生物学活性并且对脑组织缺血性损伤具有一定的保护作用。本实验釆用Langendorff离体心脏灌流技术，模拟心肌缺血再灌注损伤模型，研究发现经DGMI预处理能够有效降低离体心脏冠脉流出液AST、LDH、CK－MB活性、降低心肌组织梗死面积、抑制心肌组织病变，表明DGMI能够减轻心肌组织细胞损伤、改善心功能，提示DGMI对离体心脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

表3 各组大鼠离体心脏血流动力学指标（±s）Tab.3 Hemodynamic parameters of isolated hearts in each group（±s）

表3 各组大鼠离体心脏血流动力学指标（±s）Tab.3 Hemodynamic parameters of isolated hearts in each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数HR（次/min）LVEDP（mmHg）LVSP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）－dP/dtmin（mmHg/s）正常对照组 20 277.02±27.38 7.41±2.35 87.12±9.65 2 401.27±325.38 1 924.16±274.91模型组 20 242.98±23.82** 35.29±9.42** 61.08±9.60** 954.69±196.12** 781.88±195.34**DGMI低剂量组 20 250.74±23.73 25.99±6.17 63.94±9.75 1 045.80±214.75 896.37±203.01 DGMI中剂量组 20 261.09±24.28# 21.54±5.36# 71.83±9.61# 1 468.27±239.48# 1 140.89±231.25#DGMI高剂量组 20 267.56±26.05# 16.70±4.58## 78.90±10.17## 1 762.84±273.81## 1 492.71±244.85##维拉帕米组 20 265.00±24.03# 18.71±4.97# 74.26±9.75# 1 693.67±220.07## 1 416.02±219.74##

表4 各组大鼠离体心脏组织SOD、CAT活性及MDA 含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA of isolated hearts in each（±s）

表4 各组大鼠离体心脏组织SOD、CAT活性及MDA 含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA of isolated hearts in each（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

MDA（nmol/mgPro）正常对照组 8 67.83±4.92 37.48±4.67 3.68±0.70模型组 8 37.24±3.75** 16.29±3.50** 9.74±1.54**DGMI低剂量组 8 41.30±4.61 20.16±3.75 8.16±1.48 DGMI中剂量组 8 49.21±5.07# 24.04±3.32# 6.53±1.39##DGMI高剂量组 8 57.75±5.62## 30.95±4.38# 5.60±1.02##维拉帕米组 8 48.97±5.28# 22.16±4.31 6.82±1.17##组别 动物数 SOD（U/mgPro）CAT（U/mgPro）

表5 各组大鼠离体心脏Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力活性（±s）Tab.5 Activity of Na+-ATPase、Ca2+-ATPase of isolated hearts in each group（±s）

表5 各组大鼠离体心脏Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力活性（±s）Tab.5 Activity of Na+-ATPase、Ca2+-ATPase of isolated hearts in each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

Ca2+－ATPase（μmol Pi/mgprot/h）正常对照组 8 1.71±0.73 1.48±0.39模型组 8 0.76±0.20** 0.64±0.21**DGMI低剂量组 8 0.85±0.26 0.95±0.34 DGMI中剂量组 8 1.49±0.35# 1.32±0.38##DGMI高剂量组 8 1.91±0.62## 1.81±0.40##维拉帕米组 8 1.89±0.70## 1.80±0.39##组别 动物数 Na+－ATPase（μmol Pi/mgprot/h）

血流动力学指标正常是保证心脏功能的基础，其中 HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、－dP/dtmin是衡量血流动力学的重要指标；其中，HR能够反应心脏的整体功能，LVEDP能够反映舒张期左室内压变化、LVSP反映收缩期左室内压变化，LVEDP和LVSP能够体现心肌顺应性；+dp/dtmax反映心肌收缩程度、－dp/dtmax反映心肌舒张功能，两者是评价心肌收缩性能和舒张性能的敏感指标[7－8]。心肌缺血/再灌注可能降低心肌舒缩功能，而表现为心输出量减少及±dp/dtmax指标降低[9]。本研究发现，经DGMI预处理能够有效提高离体心脏 HR、LVDP、+dP/dtmax、－dP/dtmin并降低LVEDP，提示DGMI具有改善离体心脏缺血再灌注损伤后血流动力学的药理学作用。

氧化应激损伤是心脏组织缺血再灌注损伤的重要病理机制之一[10]，体内氧自由基代谢失衡是氧化应激损伤的病理基础，SOD、CAT是体内清楚氧自由基的关键还原酶[11－12]，MDA为脂质过氧化反应终产物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能够间接反应心肌组织损伤的程度[13]。本研究发现，经DGMI预处理能够有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示DGMI具有抑制离体心脏缺血再灌注后氧化应激损伤的作用。

综上所述，DGMI能够减轻心肌组织细胞损伤、改善心功能，提示DGMI对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，可能与DGMI能够改善血流动力学、抑制氧化应激损伤以及改善Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活性有关。