丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠认知功能的影响

刘建萍，王进博，王 洋，陈 涛

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.国家食品药品监督管理局保健食品审评中心，北京 100070）

丹芪偏瘫胶囊为国家中药6类新药，由丹参、黄芪、赤芍等14味药物组成，主要用于脑梗死的恢复期[1－2]。有研究表明，丹芪偏瘫胶囊可以增加中风患者的脑血流量[3]，改善功能性自立及神经修复[4]，对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与减轻脑水肿、抗氧化及抑制血浆内皮素（ET）生成有关[5]。临床研究表明，口服丹芪偏瘫胶囊治疗中风后遗症130例，疗程2个月，总有效率达到96.92%，患者治疗后较治疗前临床症状改善明显[6]。

慢性脑缺血又称为慢性低灌注，即慢性的脑血流量供应不足，可对脑组织造成不同程度的损伤，是临床常见的一种病理状态，具有存活率低、致残率高、病程长等特点。其多伴于血管性痴呆、阿尔茨海默病等疾病的发病过程[6]，发病的早起主要表现是认知功能的损害，而认知功能包括学习、记忆、定向能力和思维能力等内容，因此评价认知功能的主要指标是学习记忆能力的改善[7]。为探讨丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血的治疗作用，实验采用改良的Pulsinell四动脉结扎手术制备大鼠模型，观察丹芪偏瘫胶囊对脑缺血大鼠平衡及学习记忆能力的影响，为验证其治疗缺血性脑病的有效性提供实验基础。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，体质量（230±20）g（购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014－0004，置于实验室适应性饲养1周后用于实验。室温（20±2）℃，湿度60%±5%。

1.2 药品 丹芪偏瘫胶囊（批号：201505007，天津市石天药业有限责任公司生产）。

1.3 仪器 MorriS水迷宫视频分析系统（淮北正华生物仪器设备有限公司）；大小鼠疲劳仪（DXP－2，中国医学科学院药物研究所）。

2 方法

2.1 实验流程 大鼠造模前分别进行Morris水迷宫、平衡能力实验，筛选符合造模的大鼠。造模2周后，造模成功的大鼠平均分组，给药治疗。造模成功大鼠连续给药4周。

2.2 前脑缺血模型制备 四动脉结扎大鼠缺血模型（Forebrain）被广泛应用于学习记忆能力研究，是全脑缺血的经典模型。本项目拟采用本课题组前期建立的实验方法进行模型复制，简要步骤如下：大鼠禁食24 h后，颈部、头部刮毛备皮，分离双侧颈总，埋线，缝合。大鼠脑立体定位仪固定，俯卧，电凝第一颈椎横突孔下双侧椎动脉，缝合，消毒。24 h后大鼠于清醒状态，夹闭双侧颈总15 min，然后开放动脉夹再灌注。实验过程中，保持肛温（37±0.5）℃，以大鼠出现意识消失、眼球苍白、瞳孔散大、呼吸加深加快，对疼痛刺激无反应、翻正反射和瞳孔对光反射消失，为模型成功标志。模型不成功或出现惊厥癫痫状态的大鼠弃除。假手术组只分离双侧颈总，找到第一颈椎横突孔，不电凝，不夹闭颈总动脉。

2.3 实验分组和给药方法 分为假手术组、模型组、丹芪偏瘫胶囊组，根据前期实验[8]确定的丹芪偏瘫胶囊的有效剂量给药（43.2 mg/mL），模型组和假手术组给予羧甲基纤维素钠溶液。造模后2周开始给药，给药周期为1个月。模型组和假手术组给浓度为0.005 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液，给药组给浓度为43.2 mg/mL的丹芪偏瘫胶囊的羧甲基纤维素钠溶液。按正常人体质量为60 kg计算，大鼠的标准体质量为200g，丹芪偏瘫胶囊人的临床给药计量为4.8g/d，按《中国药典》体表面积计算法，大鼠给药剂量为432 mg/kg。

2.4 MorriS水迷宫实验

2.4.1 水迷宫装置 Morris水迷宫由圆形水池、平台以及记录装置三部分组成。水池用不锈钢板制成，直径1.2 m，高50 cm，厚3 mm，内壁为黑色，周围由黑色幕布围住。池壁上等距离标记东、南、西、北4个入水点，东西及南北两点连线将水池等分为4个象限，分别称西南（SW）、西北（NW）、东南（SE）及东北（NE）象限，将一个直径为12 cm、高为28 cm的圆柱形平台固定放置于SW象限的中心位置上，平台顶部没于水面下1 cm，水迷宫内置加热和测量温度装置，水温恒定，保持在（25±1）℃之间。池壁、池底及平台均用黑色胶纸粘贴，水颜色染为黑色，目的是彻底的隐藏平台，让小鼠在水中不能通过视觉来辨认平台。在水中实验的目的是使大鼠失去嗅觉感应，只能通过记忆寻找平台以达到隐蔽平台的目的。记录分析装置由摄像装置(悬挂于水池正上方约2 m处）和电脑分析系统组成。测试期间，周围环境以及水迷宫池壁上的参照物均保持不变，并保持室内安静。

2.4.2 定位航行实验 测试的前一天，为了减少应激反应对实验结果的影响，各组实验大鼠在学习训练前均被放于除去平台的Morris水迷宫中约90 s，以熟悉环境降低应激反应，适应活动结束后将平台放回原处。实验时平台位置固定不变，分别使大鼠从不同象限的入水点入水，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录鼠从入水到找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间。如果90 s内找不到平台，潜伏期记为90 s，并将鼠引于平台上记忆30 s。训练结束后计算各组动物潜伏期平均值，共进行5d。

2.4.3 空间探索实验 定位航行实验结束24 h后，撤除平台，从原平台对侧象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在90 s内的游泳路径、原平台象限的停留时间、穿越原平台位置的次数及其运动速度进行统计分析，并记录其运动轨迹。

2.5 平衡能力实验 将鼠放在大鼠疲劳仪上，第一次以4 r/min恒定转速适应2 min，20 rpm/min适应1 min。接着将疲劳仪的转速调整，调整方式为：在1 min钟按恒定速率将转速由0 rpm/min升高到28 r/min，并让大鼠在28 rpm/min转速的疲劳仪上保持5 min，在这6 min的时间内记录大鼠掉落的次数以及维持在疲劳仪上的最长时间，测3次，取平均值。

2.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理，数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05认为统计学有意义。

3 结果

3.1 小鼠水迷宫实验结果

3.1.1 定位航行实验 1）在造模前的水迷宫实验中，主要是筛掉一些个体差异比较大的大鼠，用以减小个体差异对实验结果的影响，所以只选择了基础值一样、个体差异小的大鼠来进行后续的实验。为了消除大鼠个体间的差异，特在实验造模前进行了水迷宫筛选，随着训练时间的延长，大鼠到达平台的时间会逐渐缩短，各组大鼠之间没有统计学差异（P＞0.05）。

2）给药两周后的水迷宫实验结果，见表1，将给药2周后的模型组与假手术组进行比较，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组大鼠的逃避潜伏期明显增加，同时将模型组大鼠与造模前筛选后的鼠进行比较，差异有统计学意义（P＜0.01），说明四动脉结扎手术成功造成了大鼠脑缺血，记忆能力下降。给药组和模型组比较结果表明，也存在统计学差异（P＜0.05），丹芪偏瘫胶囊给药组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，说明丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力有一定的保护作用。

3）给药4周后的水迷宫定位航行实验结果如表2所示，给药4周后，模型组与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.01），模型组的逃避潜伏期明显增加；模型组与给药组比较，亦出现统计学差异（P＜0.05），给药组逃避潜伏期明显减少,说明丹芪偏瘫胶囊能改善四动脉结扎大鼠的学习能力。

3.1.2 空间探索实验 空间探索实验主要考察大鼠在平台象限停留的时间以及穿越平台的次数，在平台象限停留时间越长、穿越平台次数越多则表示大鼠的记忆能力越强。

1）在给药2周和4周时，大鼠在平台所在象限停留时间的实验结果，见表3。在给药2周和4周时分别进行空间探索实验，给药2周时的实验结果显示，模型组大鼠在平台所在象限的停留时间相比于假手术组明显缩短（P＜0.01），丹芪偏瘫胶囊给药组与模型组相比，给药组大鼠的停留时间明显增加（P＜0.01）；给药4周的实验结果显示，模型组与假手术组相比，模型组大鼠在平台所在象限停留的时间明显减少（P＜0.05），丹芪偏瘫胶囊给药组与模型组相比，给药组大鼠的停留时间显著增高（P＜0.01），说明丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎所致的慢性脑缺血大鼠的记忆能力具有改善作用。

2）在给药2周和4周时，大鼠穿越平台次数的实验结果，见表4。在给药2周和4周时的大鼠穿越平台次数的实验结果显示，给药2周时，模型组与假手术组相比，模型组的大鼠穿越平台的次数明显减少（P＜0.01），丹芪偏瘫胶囊给药组和模型组相比较，穿越平台的次数增加（P＜0.05）；给药4周时，模型组与假手术组相比，模型组大鼠穿越平台的次数明显较少（P＜0.05），丹芪偏瘫胶囊给药组与模型组相比较，给药组大鼠穿越平台的次数明显增多（P＜0.01），以上实验结果说明丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎大鼠的记忆能力有明显的改善作用。

3.2 转棒实验结果 转棒实验主要考察大鼠从转棒上掉落下来的次数和在转棒上停留的最长时间，实验结果如下所示。

3.2.1 丹芪偏瘫胶囊对大鼠掉落次数的影响的实验结果 见表5。为了消除大鼠个体间的差异性，在造模前对大鼠进行了转棒筛选，去除个体差异较大的，选择个体之间差异性小的大鼠进行下一步实验。造模前各组之间的掉落次数差异较小（P＞0.05），而在造模完成后，分别给药2周和4周的转棒实验数据显示，模型组与假手术组相比，模型组大鼠的转棒掉落次数明显增加（P＜0.01），与丹芪偏瘫胶囊给药组相比，给药组的掉落次数明显下降（P＜0.01），说明丹芪偏瘫胶囊能明显减少由四动脉结扎所致慢性脑缺血大鼠的转棒掉落次数，对认知功能具有显著的改善作用。

表1 丹芪偏瘫胶囊对给药2周后四动脉结扎大鼠学习能力的影响（±s）Tab.1 Effect of Danqi Piantan capsule on the learning ability of four artery ligation rats after two weeks of administration（±s）s

表1 丹芪偏瘫胶囊对给药2周后四动脉结扎大鼠学习能力的影响（±s）Tab.1 Effect of Danqi Piantan capsule on the learning ability of four artery ligation rats after two weeks of administration（±s）s

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数模型组 10假手术组 10丹芪偏瘫胶囊给药组 10 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 89.08± 2.35** 74.48±21.96** 83.53±7.81** 61.87±27.50 68.97±17.59**47.81±10.56 35.07±16.15 32.44±8.01 36.81± 6.77 22.35± 4.64 61.47±11.89## 39.27±10.23 26.82±6.88## 34.17± 9.86 19.10± 9.47#

表2 丹芪偏瘫胶囊对给药4周后四动脉结扎大鼠学习能力的影响（±s）Tab.2 Effect of Danqi Piantan capsule on learning ability of the four artery ligation rats after four weeks of administration（±s）s

表2 丹芪偏瘫胶囊对给药4周后四动脉结扎大鼠学习能力的影响（±s）Tab.2 Effect of Danqi Piantan capsule on learning ability of the four artery ligation rats after four weeks of administration（±s）s

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数模型组 10假手术组 10丹芪偏瘫胶囊给药组 10 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 76.23±15.51 72.41±16.85** 53.40±18.25** 51.37±14.07 63.73±22.50**57.31±23.04 29.94± 9.16 20.56± 4.61 28.70± 3.52 24.40± 8.64 70.62±26.21 41.72±11.36## 24.20± 6.91## 38.34± 5.87# 16.48± 4.76##

表3 丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎大鼠平台象限停留时间的影响（±s）Tab.3 Effect of Danqi Piantan capsule on the quadrant residence time of the four artery ligation rats（±s）s

表3 丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎大鼠平台象限停留时间的影响（±s）Tab.3 Effect of Danqi Piantan capsule on the quadrant residence time of the four artery ligation rats（±s）s

注：与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 给药4周模型组 16.21±5.43#假手术组 26.03±8.75丹芪偏瘫胶囊给药组 37.35±9.95**动物数10 10 10给药2周16.95±6.97##39.86±10.47 30.4±7.08**

表4 丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎大鼠穿越平台次数的影响（±s）Tab.4 Effect of Danqi Piantan capsule on the number ofcross platform of four artery ligation rats（±s）s

表4 丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎大鼠穿越平台次数的影响（±s）Tab.4 Effect of Danqi Piantan capsule on the number ofcross platform of four artery ligation rats（±s）s

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 4周模型组 1.00±0.98*假手术组 2.17±0.75丹芪偏瘫胶囊给药组 3.00±0.63##动物数10 10 10 2周1.16±0.75**2.67±0.82 2.33±0.52#

表5 丹芪偏瘫胶囊对大鼠掉落次数的影响（±s）Tab.5 Effect of Danqi Piantan capsule on the number of falling rats（±s） 次

表5 丹芪偏瘫胶囊对大鼠掉落次数的影响（±s）Tab.5 Effect of Danqi Piantan capsule on the number of falling rats（±s） 次

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别模型组假手术组丹芪偏瘫胶囊给药组动物数10 10 10造模前 2周 4周4.94±1.89 20.89±4.03**10.67±4.39**5.20±2.00 3.78±1.88 3.05±1.02 4.61±1.91 5.56±0.98## 2.00±0.52##

3.2.2 丹芪偏瘫胶囊对大鼠最长停留时间的影响的实验结果 见表6。由以上实验结果显示，造模前大鼠在转棒上的最长停留时间无统计学差异（P＞0.05），而在造模完成给药2周和4周后，模型组与假手术组相比，模型组大鼠的最长停留时间明显减少（P＜0.05），丹芪偏瘫胶囊给药组与模型组相比，给药组大鼠在转棒上的最长停留时间明显增加（P＜0.05），说明丹芪偏瘫胶囊能明显增加慢性脑缺血大鼠在转棒上的最长停留时间，对大鼠的认知功能具有明显的改善作用。

表6 丹芪偏瘫胶囊对大鼠最长停留时间的影响（±s）Tab.6 Effect of Danqi Piantan capsule on the longest residence time in rats（±s）

表6 丹芪偏瘫胶囊对大鼠最长停留时间的影响（±s）Tab.6 Effect of Danqi Piantan capsule on the longest residence time in rats（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

分组模型组假手术组丹芪偏瘫胶囊给药组动物数10 10 10造模前 2周 4周109.5±34.99 30.32±15.04* 19.72± 5.13**99.00±25.30 110.72±42.28 114.11±31.29 104.00±34.79 78.45±28.61##115.78±18.39##

4 讨论

认知功能包括学习、记忆、定向能力和思维能力等内容，因此评价认知功能的主要指标是学习记忆能力的改善。由于慢性脑低灌注导致认知功能障碍和痴呆的病理生理机制尚未阐明，因而目前亦缺乏特异性的临床防治措施。近年来，国内针对中药提取物和中药制剂对脑缺血再灌注后认知功能影响方面的实验研究越来越多。目前常用的建立慢性脑低灌注大鼠模型的方法有双侧颈总动脉结扎法（BCCAO）[9－10]和改良的 Pulsinell[11]四动脉结扎法等。本实验采用改良的Pulsinell四动脉结扎手术[12]，术后大鼠脑组织出现明显的缺血，行为学上表现为空间探索能力、学习、认知以及记忆能力显著下降。此法被国内外学者广泛推崇，是目前复制慢性脑缺血模型的常用方法之一，但此法受动物个体差异的影响较为严重，故在实验模型复制前需对动物做初步的筛选，减少动物之间的个体差异对实验结果的影响。

目前评价慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力的常用行为学方法有Morris水迷宫实验、网屏悬挂实验、转棒实验、避暗实验、跳台实验等[13－19]。

本实验采用Morris水迷宫实验和转棒实验来评价慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力。在水迷宫实验中，随着训练时间以及次数的增加，大鼠会逐渐学习并记住水中平台的位置，故到达平台的时间（逃避潜伏期）会减少，表明大鼠的学习记忆能力的增强。模型组与假手术组及丹芪偏瘫胶囊给药组相比较，模型组大鼠的逃避潜伏期均明显高于假手术组和丹芪偏瘫胶囊给药组，说明丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠的学习能力有一定的改善作用。定位航行实验结果显示模型组与假手术组比较到达平台时间、第一次到达平台时间均显著增加，穿越平台次数和平台所在象限停留时间均显著减少，表明模型组出现了明显的认知功能障碍。与模型组比较，大鼠穿越平台的次数以及在平台所在象限停留的时间均比假手术组和丹芪偏瘫胶囊给药组大鼠明显缩短，说明丹芪偏瘫胶囊对慢性脑缺血大鼠的记忆能力有一定的改善作用。

在转棒实验中，随着训练学习次数的增加，大鼠对转棒的转速有了一定的适应记忆能力，故随着训练次数的增加，大鼠的掉落次数会明显减少，在转棒上停留的时间会明显的增加。实验结果显示，模型组与假手术组和丹芪偏瘫胶囊给药组比较掉落次数显著增加，最长停留时间均显著减少，表明模型组出现了明显的平衡能力障碍。与模型组相比，丹芪偏瘫胶囊组可在一定程度上改善大鼠的平衡能力。综上所述，丹芪偏瘫胶囊对四动脉结扎所致的慢性脑缺血大鼠的学习、记忆等认知功能有一定的保护作用。此结论提示丹芪偏瘫胶囊治疗慢性脑缺血可能与其改善认知功能障碍具有一定的关系，具体的作用机制还有待深入研究。