高表达水通道蛋白7的脂肪细胞的脂代谢的研究

白晓苏 黎智森

[摘要] 目的 研究高表达AQP7的 3T3-L1 脂肪细胞的脂代谢变化。 方法 构建高表达的AQP7的 3T3-L1 脂肪细胞，测定AQP7mRNA和AQP7蛋白表达的变化，以及脂代谢指标甘油和脂肪酸的变化。 结果 与对照组比较AQP7mRNA和AQP7蛋白表达明显增加差异有统计学意义（P<0.01），培养基中甘油的水平也升高差异有统计学意义（P<0.05），脂肪酸的水平无变化差异有统计学意义（P>0.05）。 结论 高表达的AQP7蛋白，可显著减少脂肪细胞内甘油，减少脂肪细胞体积，减轻胰岛素抵抗。

[关键词] 脂肪细胞；水通道蛋白7；甘油

[中图分类号] R58 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2018）01（b）-0025-02

随着生活环境的改变，2 型糖尿病的（T2DM）的发生逐渐增加，T2DM是心脑血管疾病的独立危险因素。肥胖与T2DM的发生密不可分，胰岛素抵抗是二者的共同土壤，脂肪细胞的体积肥大和脂肪细胞数量的增加是引起体内脂肪蓄积及代谢异常的重要诱因[1-2]。脂肪细胞内的与甘油转运的的水通道蛋白7（AQP7）表达的下降，与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的形成有关。该文将探讨高表达AQP7的3T3-L1 脂肪细胞的脂代谢的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

pMD18T载体；Lipofectamine 2000及逆转录试剂盒转染试剂盒；3T3脂肪细胞。PCR仪，荧光定量仪。RNA 提取及逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司；抗AQP7 抗体购自艾博抗贸易有限公司，甘油含量酶法测定试剂盒购自普利莱基因有限公司； 游离脂肪酸测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其余试剂为市售分析纯。

1.2 方法

高表达APQ7的3T3脂肪细胞的建立对合成ap2的-63bp/5.4-4.9kb的启动调节区和AQP7基因的CDS區全序列进行分析，构建载体 ap2-AQP7。 构建的腺病毒表达载体ap2-AQP7经Pac I消化后Lipofectamine 2000转染293A细胞，包装病毒，收集病毒原液，并采用免疫法检测腺病毒滴度，以不含ap2-AQP7的空载腺病毒作为阴性对照。转染载体ap2-AQP7的3T3-L1 脂肪细胞培养至生长状态良好后，进行诱导分化。病毒感染3T3脂肪细胞后48 h收集细胞，行RT-Q-PCR检测，估算目的基因含量，建立高表达的APQ7的3T3脂肪细胞模型。

测定脂肪细胞的AQP7的蛋白水平以及甘油、FFA 的含量的测定用试剂盒检测AQP7的蛋白水平，以及测定培养基的甘油、游离脂肪酸的含量。

1.3 统计方法

采用 SPSS 18.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料用平均数±标准差（x±s）表示行t检验，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3脂肪细胞的AQP7mRNA以及蛋白的表达的变化与对照组比较

试验组的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表达明显高于对照组差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.2 培养基的甘油、脂肪酸的测定

测定培养基上清的甘油含量，发现甘油含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05 ）。脂肪酸的含量无变化，差异无统计学意义（P>0.05 ）。见图1。

3 讨论

糖脂代谢的异常形成和加重了糖尿病胰岛素抵抗。葡萄糖进入脂肪组织可以转化为甘油三酯，而脂肪组织可释放游离脂肪酸参加氧化供能。因此，游离脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖构成极其复杂的能量代谢网络，这一网络的某些环节出现问题将导致肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、血脂紊乱、动脉粥样硬化、泡沫细胞形成等病理变化[3]。迄今为止，在哺乳动物体内共发现13种水通道蛋白亚型[4]。脂肪组织只表达AQP7，尤其是在内脏脂肪组织[5]。该课题组[6]利用只在成熟脂肪细胞表达的aP2基因，将其与AQP 7cDNA连接，转入在脂肪组织内并特异性高表达，与对照组比较，试验组的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表达明显增加。高表达AQP7的3T3脂肪细胞株的培养基中，甘油含量明显高于对照组，亦进一步证明，AQP7蛋白的表达增加可促进甘油向脂肪细胞外进行排泄，为肥大的脂肪细胞减负[7]。在该实验中，脂肪酸的含量无变化。MaedaN 等[8]对AQP7缺陷小鼠血浆中的甘油测定发现，其浓度明显降低，但游离脂肪酸的浓度无显著变化，这说明脂肪细胞膜上的AQP7只选择性介导了甘油从细胞中的释放而不运输脂肪酸。这将利于维持组织液和血浆中中的游离脂肪酸稳定，不仅限制了脂肪酸的再次酯化，而且也防止了高游离脂肪酸水平抑制葡萄糖氧化，加重胰岛素抵抗[9]，加重肥胖。

综上所述，构建的含有ap2-AQP7的脂肪细胞可高表达的AQP7mRNA和AQP7蛋白，脂肪细胞内高表达的AQP7可显著减少了脂肪细胞内的甘油含量，将甘油向细胞外转运，进而缩小了脂肪细胞的体积，同时游离脂肪酸的水平的稳定，不加重胰岛素抵抗所带来的对机体的损坏。

[参考文献]

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[2] Thankamony A， Tossavainen PH， Sleigh A， et al. Short-term administration of pegvisomant improves hepatic insulin sensitivity and reduces soleus muscle intramyocellular lipid content in young adults with type 1 diabetes[J].J Clin Endocr inol Metab，2014，99（2）：639-647.

[3] 徐國恒.脂肪细胞和细胞内油滴与肥胖和代谢综合征[J].郑州大学学报：医学版，2008，43（1）：1-5.

[4] Verkman， A.S. More than just water channels：unexpected cellular roles of aquaporins[J].Cell Sci，2005，118（15）：3225-3232.

[5] Appel SJ，Jones ED.Kennedy-Malone L Central obesity and the metabolic syndrome：implications for primary care provid-ers[J].Am Acad Nurse Pract，2004，16（8）：335-342.

[6] 白晓苏，陆泽元，邵豪.含有 ap 2 启动子/增强子、 AQP7c DNA 的腺病毒载体的构建及鉴定[J]. 医学临床研究， 2014，31（5）：856-858.

[7] Sjholm K，Palming J，Olofsson LE， et al. A microarray search for genes predominantly expressed in human omental adipocytes： adipose tissue as a major production site of serum amyloid A[J].Clin Endocrinol Metab，2005，90（4）：2233-2239.

[8] Maeda N， Funahashi T， Hibuse T，et al.Adaptation to fasting by glycerol transport through aquaporin 7 in adipose tissue[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：17801-17806.

[9] Arner P， Rydén M.Fatty Acids， Obesity and Insulin Resist ance[J].Obes Facts，2015，8（2）：147-155.

（收稿日期：2017-10-24）