青稞萌动过程中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚的含量研究

邓俊琳 朱永清 陈 建 陆荣荣 夏 陈邓海云 王嘉怡 潘姝璇 张盈娇 高 佳

(四川省农业科学院农产品加工研究所1，成都 610066) (四川大学华西公共卫生学院2，成都 610041) (四川农业大学食品学院3，雅安 625014)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum Hook. F.)属禾本科大麦属，亦称裸大麦，在我国主要分布于西藏、青海、四川甘孜州和阿坝州、甘肃的甘南等高海拔地区[1]。青稞适应性强、产量高，病虫害少，较少使用农药，是青藏高原地区农牧民的主要食粮[2]。青稞具有高蛋白质、高膳食纤维、低脂肪等营养特点，适于三高人群，是每日膳食中优质的谷物来源。青稞中人体必需氨基酸齐全，尤其富含一般谷物中所缺乏的赖氨酸，其含量高达0.36 g/100g[1]。青稞中的β-葡聚糖含量居全球大麦之最，研究表明β-葡聚糖具有降血糖、降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，对预防心血管疾病、糖尿病等有显著作用[3-5]。青稞中富含γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸[C4H9NO2]是一种游离氨基酸，作为一种天然非蛋白质氨基酸，是脊椎动物交感神经细胞结合点的抑制性神经传递物质，研究表明其具有降血压、改善脑功能、调节激素的分泌等作用[6-7]。有报道称，γ-氨基丁酸的合成会因缺氧、避光、热处理或者胞质酸化等外界环境刺激而加强[8]。另外，研究表明全谷物与氧化应激相关的慢性病有密切联系，在一定程度上有助于缓和慢性病发展，其机制可能与全谷物中的多酚成分有关[9]。多酚类化合物作为谷物中的主要抗氧化成分，被认为是全谷物发挥作用的主要物质基础[10]。青稞中富含类黄酮、花青素等酚类物质，这些抗氧化物质，可能在抗癌、抗衰老等方面发挥重要功效。

目前已有研究发现，谷物在萌动过程中，其所含水分增加到一定程度时，激活处于休眠状态的酶，使其由结合态转变成游离态，从而促进酶解作用，使谷物中的化学物质及其含量发生不同程度的变化，对人体而言，这些变化大部分是有益的[11-12]，因此，萌动谷物可用于制作食品、保健品和化妆品等。国外对于小麦、大麦等谷物均有萌动研究[13]，但对青稞尚鲜见萌动研究，国内对青稞萌动研究较少，仅有关于萌动青稞中β-葡聚糖[14]和胡萝卜素[15]的研究。青稞作为青藏高原重要的粮食作物，对其营养成分的深层挖掘和充分利用有着重要意义。本实验对青藏高原的5个青稞品种在不同萌动阶段β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和总多酚三种活性物质的含量进行研究，探索其变化趋势以确定最佳的青稞萌动条件，为生产富含功能活性物质的萌动青稞及其增值功能食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 青稞样品

康青7号(甘孜州农业科学研究所提供)；独立花、紫青稞(若尔盖县多尔玛藏族食品有限公司提供)；藏青25号、西藏2000(西藏自治区农牧科学研究院农业研究所提供)。收获期均为2016年9月。

1.2 主要仪器和试剂

LHS-250HC-11型恒温恒湿箱：上海一恒科技仪器有限公司； KH2200DE型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；ELX-800型号酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；UV-6100型号紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；PHS-3C型酸度计：上海科佑仪器仪表有限公司。

Megazyme试剂盒：爱尔兰Megazyme公司；γ-氨基丁酸标准品(色谱纯)：美国Fluka公司；乙腈、甲醇(色谱纯)：美国MREDA公司；福林酚(分析纯)：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、乙酸钠、冰乙酸等(均为分析纯)：成都市科龙化工试剂厂。

1.3 实验方法

1.3.1 青稞萌动[16]

每组50.0 g完整的青稞颗粒，0.5%次氯酸钠浸泡30 min消毒，蒸馏水洗涤5次，置于27 ℃蒸馏水浸泡6 h，每组青稞样品分别按照相对应的温度和时间在培养皿中萌动：在不同温度下(15、22、30 ℃)将康青7号青稞样品进行萌动处理，萌动结束后于90 ℃干燥箱中灭酶20 min，60 ℃干燥箱中烘干至恒重，打粉过60目筛，检测β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和总多酚，以三种物质的含量最高时的萌动温度选为最适温度；在此最适温度下，将5个品种的青稞样品在不同时间下(0、15、27、39、63、87、111 h)进行萌动处理，灭酶、干燥、打粉、过筛，冷冻储藏备用。

1.3.2 葡萄糖氧化酶-过氧化酶法(Glucose oxidase/peroxidase method，GOPOD)测定β-葡聚糖含量[17]

1.3.2.1 样品处理

精确称取青稞粉0.100 g于15 mL离心管中，加入0.2 mL 50%乙醇溶液，振荡混匀，再加入4.0 mL 磷酸盐缓冲液(20 mmol/L，pH 6.5)，振荡混匀。置于沸水浴中5 min，每隔半分钟取出于漩涡振荡器混匀，防止其结块。50 ℃水浴5 min，加入0.2 mL 地衣酶(10 U)，于50 ℃恒温水浴锅中酶解1 h ，期间震荡3～4次。加入5 mL醋酸钠缓冲液(200 mmol/L，pH4.0)，混匀5 min，1 000 r/min离心 10 min，上清液即为待测样品液。

1.3.2.2 显色反应

96孔板中样品组加入7 μL样品上清液和7 μL β-葡聚糖苷酶，样品对照组用7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸盐缓冲液代替β-葡聚糖苷酶，标准品组加7 μL标准液和7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸盐缓冲液，空白组加7 μL蒸馏水和7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸盐缓冲液，50 ℃水浴10 min。加入200 μL GOPOD混合液，50 ℃水浴20 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度值。每组测定8个平行样，重复测量2次。

1.3.2.3 结果计算

式中：ΔA为样品组吸光度值-样品对照组吸光度值；F为100/(标准品组吸光度值-空白组吸光度值)；Fv为总体积/mL；m为样品质量/mg；D为稀释倍数为1。

1.3.3 HPLC法测定γ-氨基丁酸含量[18]

1.3.3.1 样品处理

精确称量青稞粉1.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL 70%乙醇，40 ℃超声40 min，6 000 r/min离心5 min。

1.3.3.2 样品衍生

衍生剂配制：准确称取 20 mg邻苯二甲醛、4 mg pH 9.5的硼酸缓冲液、1 mL甲醇和100 μL 2-巯基乙醇，混合均匀；取300 μL样品上清液于1.5 mL离心管中，加入150 μL现配的衍生剂反应4.5 min，立即加入300 μL 0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，立即进样，每个样品重复测量3次。

1.3.3.3 色谱条件

Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为20 mmol/L醋酸钠，B为乙腈；流速为1 mL/min，梯度洗脱：0 min(90% A)，15 min(65% A)，20 min(10% A)，22 min(90% A)；柱温为40 ℃；进样量10 μL；紫外检测波长332 nm。

1.3.3.4 标准曲线

取γ-氨基丁酸标准品，配制成0.275、0.206、0.137、0.103、0.082 4、0.068 7 mg/mL标准品溶液，同1.3.3.2步骤衍生并用液相测定，以峰面积为纵坐标和标准液浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=8 806.0X-111.1(R2=0.999)，线性范围0.044～1.1 mg/mL。

1.3.4 福林酚法测定多酚含量[19]

1.3.4.1 样品的处理同1.3.3.1。

1.3.4.2 显色反应

取100 μL提取液，加入3.0 mL蒸馏水和200 μL福林酚，混匀并放置5 min，再加入800 μL 10% NaCO3溶液，避光1 h，紫外分光光度计在765 nm测吸光值。

1.3.4.3 标准曲线

称取0.035 1 g没食子酸，100 mL蒸馏水定容配成351 μg/mL没食子酸标准液，用不同浓度梯度的没食子酸标准液(17.55、35.1、70.2、105.3、140.4、175.5、210.6、245.7、280.8、315.9、351 μg/mL)与福林酚显色，于765 nm处测吸光度值，得标准曲线为Y=0.002 9X+0.0263(R2=0.998 2)。

1.4 数据分析

所有数据均为3次重复实验的平均值，采用Microsoft Excel 97-2003进行数据处理作图， 采用SPSS20.0统计软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 最适萌动温度

如图1所示，随机选择康青7号青稞样品在15、22、30 ℃萌动15小时，β-葡聚糖含量随萌动温度变化不大，而γ-氨基丁酸和多酚的含量均在22 ℃萌动时最高。因此，将最适萌动温度确定为22 ℃。

图1 不同萌动温度下康青7号青稞的β-葡聚糖含量(a)和γ-氨基丁酸、多酚含量(b)

2.2 萌动青稞的形态

如图2所示，康青7号和独立花萌动时间早，111 h时叶芽长度较长；紫青稞、藏青25号和西藏2000萌动时间晚，111 h时叶芽长度较短。

图2 五种青稞样品在不同时间下22 ℃萌动的形态

2.3 萌动时间对青稞β-葡聚糖含量的影响

如图3所示，独立花中β-葡聚糖含量先下降后略有上升，再下降，其中，其萌动青稞中β-葡聚糖含量显著高于萌动后的，这与其他四个品种的青稞有明显区别。康青7号、紫青稞、藏青25和西藏2000有相似的变化趋势，随着萌动时间的延长，β-葡聚糖含量先增加后下降，且含量最高出现于萌动15～63 h之间，5个品种中含量最低均出现于111 h。此外，5个品种中，藏青25号中β-葡聚糖含量在萌动的各个时期，含量均显著高于同时期萌动的其他品种，康青7号中各个萌动时期中含量均小于或近似于其他品种。品种间基因型不同和萌动条件(包括温度、时间、酸碱度、金属离子等)不同可能是通过影响青稞中β-葡聚糖合成酶和β-葡聚糖酶活性的强弱，从而改变青稞中β-葡聚糖的含量[20]。

注： 小写字母：同一品种不同萌动时间β-葡聚糖含量的差异显著性分析(组内)；大写字母：同一萌动时间不同品种β-葡聚糖含量的差异显著性分析(组间)。
图3 五种青稞中β-葡聚糖含量随萌动时间的变化

本实验中，不同品种的青稞经过不同时间的萌动，β-葡聚糖含量的变化趋势不完全相同，但就整体而言，萌动后比萌动前有所减少，这一结果与燕麦和大麦[20-21]等的研究结果一致。减少的原因可能是青稞在萌发中，胚上皮层细胞分泌的赤霉酸刺激胚乳糊粉层细胞，从而合成一系列的葡聚糖酶，葡聚糖酶合成后会随着水分而渗出，然后水解青稞细胞壁上和细胞间的葡聚糖[22]。青稞在萌动过程中葡聚糖合成酶和葡聚糖酶共同作用，在初期葡聚糖合成酶强于葡聚糖酶[23]，所以藏青25号和西藏2000 的β-葡聚糖增加，但后期由于葡聚糖酶活力增强β-葡聚糖含量会随萌动时间的延长而减少[24]。因此在实际生产中要控制萌动时间的长短，以达到其他生物活性物质增加的同时尽量保持多含量的β-葡聚糖。

2.4 萌动时间对青稞γ-氨基丁酸含量的影响

如图4所示，萌动青稞中γ-氨基丁酸在11.5 min 左右出峰，分离度较高。如图5所示，5个品种的萌动青稞中γ-氨基丁酸含量随萌动时间的延长，并不完全相同，但整体上均有萌动后γ-氨基丁酸含量高于萌动前含量的变化，这与Ohtsubo等[25]报道的糙米萌动后γ-氨基丁酸含量升高和曾亚文等[26]报道的大麦籽粒萌动后γ-氨基丁酸含量增加的结果相近。由图5可知，γ-氨基丁酸含量最高多出现于萌动的中期或后期，即藏青25号含量最高在萌动39 h，康青7号在萌动87 h，独立花、紫青稞和西藏2000在萌动后的111 h。在5个青稞品种中，藏青25号和西藏2000中的各个时期，γ-氨基丁酸含量均较其他品种的高。其中，西藏2000的在萌动111 h处，含量达到最高，为61.36 mg/100 g。郑向华等[27]研究温度和时间对萌动糙米中γ-氨基丁酸含量的影响，萌动后γ-氨基丁酸含量随萌动时间的延长，表现为先增加后减少，再增加又减少，这与本次试验中康青7号的γ-氨基丁酸得变化一致。研究表明，γ-氨基丁酸在豌豆、黄豆、扁豆等豆类以及燕麦、小麦和荞麦等谷物中，萌动后含量均高于萌动前含量[13]。此外，本实验中青稞萌动后γ-氨基丁酸含量在11.7～60.32 mg/100 g，其含量远高于Hung等[28]报道的小麦经萌动处理(6～48 h)后的含量(3.4～16.0 mg/100 g)和Jian等[29]报道的燕麦经萌动(1～7 d)后的含量(5.71～20.4 mg/100 g)。γ-氨基丁酸增加的原因可能是谷氨酸脱羧酶被激活，催化谷氨酸不可逆的脱去α位上的羧基形成γ-氨基丁酸；降低的原因可能是γ-氨基丁酸在γ-氨基丁酸转氨酶的催化下和丙酮酸或α-酮戊二酸发生转氨作用生成琥珀酸半醛[28-30]。

图4 γ-氨基丁酸对照品和青稞样品的高效液相色谱图谱

注：小写字母：同一品种不同萌动时间γ-氨基丁酸含量的差异显著性分析(组内)；大写字母：同一萌动时间不同品种γ-氨基丁酸含量的差异显著性分析(组间)。
图5 五种青稞中γ-氨基丁酸含量随萌动时间的变化

2.5 萌动时间对青稞多酚含量的影响

如图6所示，不同品种的青稞经过不同时间的萌动，多酚含量的变化趋势不完全相同。紫青稞、藏青25号和西藏2000有相似的变化趋势，均呈现下降、上升、下降、再上升的趋势，其中，分别在萌动27 h和萌动39 h多酚含量最高，康青7号的变化趋势与之相反，且萌动39 h除外，其余萌动时间处，多酚含量均接近或高于其他品种。独立花随萌动时间延长，其多酚含量先降低后略有回升。其中含量最高为康青7号萌动87 h，250.8 mg/100 g。 本次实验测量的多酚含量主要是游离型总酚，多酚含量下降的原因可能是游离型多酚在浸泡过程中可以溶解到水中，同时萌动初期多酚氧化酶活性处于较高水平，也会降解一部分多酚；多酚含量增加的原因可能与萌动中多酚氧化酶的活性降低和羟氨基苯甲酸-N-羟基肉桂酸转移酶(HHT)活性升高有关[31]。

注：小写字母：同一品种不同萌动时间多酚含量的差异显著性分析(组内)；大写字母：同一萌动时间不同品种多酚含量的差异显著性分析(组间)。
图6 五种青稞中的多酚含量随萌动时间的变化

2.6 相关性分析

经统计分析，萌动青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚的含量变化无显著相关性(P<0.05)。

表1 萌动青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚的含量的相关性分析(P<0.05)

3 结论

青稞在整个萌动过程中，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚含量随萌动时间的变化在不同品种内不完全相同，且三者的变化无显著相关性。就整体而言，β-葡聚糖萌动后比萌动前含量下降，γ-氨基丁酸萌动后比萌动前增加，多酚含量在不同品种间变化差异较大。萌动前，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚在藏青25号中的含量均高于其他品种中，萌动后，β-葡聚糖在藏青25号中的含量显著高于同时期萌动的其他品种，γ-氨基丁酸在藏青25号和西藏2000中的含量均较其他品种同时期的高，多酚在康青7号中含量较高。在萌动温度为22 ℃时，康青7号萌动87 h、西藏2000萌动27 h、紫青稞和藏青25号萌动39 h，可以得到四种青稞中三类物质较佳含量；而独立花青稞不适合做萌动处理。本研究为青稞的精深加工提供了借鉴。