毕赤酵母发酵表达金属硫蛋白的制备及活性

曹慧娟，徐君辉，邹俊杰，张宾，孙继鹏

（1.舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，浙江舟山 316021）（2.浙江海洋大学，浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室，浙江舟山 316022）（3.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361000）

MT广泛存在于动物、植物及微生物体内，可被重金属离子、细胞毒性药物、有机化学药物及应激刺激等诱导合成。国内市场上常见MT产品，大部分来自兔肝脏中提纯获得，但其原料来源较为特殊，生产工艺复杂，提纯过程操作繁杂、产量极低且价格极其昂贵[3]。与动植物源提取相比，通过微生物源（如酵母、枯草芽孢杆菌等）诱导表达产生 MT，具有来源广、成本低、发酵周期短等优点[4]。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）在用于表达异源蛋白方面具有诸多优点，如酵母细胞易于分子遗传学操作、生长速度快及生物毒性低，其适于外源基因的高水平诱导表达，还可进行高密度细胞培养，利于大规模工业化生产[5]。

关于微生物源的MT提取及分离纯化方法，诸如加热除杂蛋白、缓冲液匀浆离心法、凝胶过滤、离子交换及多种层析结合法等，由于微生物生长代谢的复杂性，仍存在如杂蛋白干扰严重、MT提取率不高等问题，其分离纯化方法仍有待进一步提高。课题组前期以巴斯德毕赤酵母为对象，经培育诱导条件优化（摇床转速为 220 r/min，甲醇诱导剂 5%，CuCl2诱导剂50 μmol/L，诱导时间24 h），培养发酵液中MT诱导表达量达0.29 mg/mL（结果另文报道）。本研究以巴斯德毕赤酵母发酵液为对象，对其中MT的提取分离及纯化条件进行优化，并初步评价获得MT的清除自由基活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达菌株（GS-115），由国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源综合利用工程技术研究中心（厦门）经基因重组获得；考马斯亮兰 G-250、茚三酮及苯酚等，西陇化工股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等，北京索莱宝科技有限公司；Tris-(2-carboxylethyl)-phosphine（TCEP）、Ammnium 7-Fluoro-2,1,3-bzoxadiazole- 4-sulfonate（SBD-F）及金属硫蛋白标准品（来自兔肝）等，Sigma-ALDRICH上海贸易有限公司。以上实验所用试剂，均为分析纯。

Waters 2475荧光检测器、Waters e2695高效液相色谱仪，沃特世科技有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；SCINOTMKT260凯氏定氮仪、SCINOTMDT208高温消化炉，瑞士 FOSS公司；SRMXM-4平板膜分离设备，三达膜科技有限公司；多功能全自动层析系统，上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 酵母发酵MT的制备

依据课题组前期研究[3]，将毕赤酵母菌进行培育、诱导表达，制备MT发酵液工艺：将酵母在培育温度30 ℃，初始pH 9.0，摇床转速240 r/min和菌种接种量4%条件下，进行摇瓶培育20 h；随后将培育后酵母加入CuCl2进行诱导发酵，具体在菌体密度 OD6009.7，摇床转速220 r/min，诱导剂甲醇终浓度5%（V/V）和CuCl2终浓度50 μmol/L条件下，进行诱导表达24 h，获得含MT的毕赤酵母发酵液（结果另文报道）。

1.3 酵母发酵液的预处理

1.3.1 高温沉降法除杂

其实，这次真的是易非误会了，他们只是想对易非客气，想别吵着她了，可这突如其来的客气，反倒让易非觉得生疏和孤单。

将30 mL发酵液分别置于50、60、70和80 ℃水浴条件下，恒温保存0、10、20、30、40、50和60 min，取出后常温冷却至室温，8000 r/min离心 20 min（4 ℃），取上清液测定MT含量；同时取沉淀物进行称重，考察高温沉降对发酵液中MT稳定性及杂质去除效果影响。

1.3.2 等电点沉淀法除杂

准确量取1.0 mL发酵液分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和100 μL，4 mol/L HCl溶液，充分混匀后，8000 r/min离心20 min（4 ℃），取上清液测定总蛋白质和MT含量，考察等电点法对发酵液中MT耐酸性及杂质去除效果影响。蛋白质含量测定，采用考马斯亮兰法进行。

1.4 酵母发酵液中MT的膜分离

将经预处理后酵母发酵液，经截留分子量为50 ku硝酸纤维膜超滤膜，以去除发酵液中其它杂质，获得MT浓缩液经冷冻干燥后即为MT粗提物。膜分离参数：进口压力0.5 MPa，出口压力0.2 MPa，超滤温度26 ℃。考察膜分离对发酵液中杂蛋白去除效果及对MT截留率影响。

1.5 发酵液中MT的纯化

采用凝胶层析法对MT粗提物进一步纯化，具体参数：DEAD-FF琼脂糖凝胶为层析介质，MT粗提物上样浓度0.6 mg/mL，样品溶液pH 8.5，上样流速1.0 BV/h。样品吸附饱和后，采用 pH 8.5，10 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱吸附杂蛋白，进而通过pH 8.5，含 0.6 mol/L NaCl的 Tris-HCl缓冲液洗脱目标蛋白（MT），层析分离收集MT。进一步将收集的MT溶液，调节pH至6.0，加入0.1 mol/L EDTA（实验中，采用CuCl2进行诱导表达，获得MT多以MT-Cu2+形式存在，需进一步去除Cu2+），混匀反应10 min后，经SephadexG-25脱盐，冷冻干燥制备MT纯化样品。

1.6 纯化MT活性评价

利用H2O2与Fe2+混合体系模拟产生OH·自由基，通过显色剂结晶紫与OH·发生亲电加成反应而褪色作考察指标，评价制备MT对OH·清除能力[6]。利用邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，产生 O2-·自由基与反应物，评价制备 MT对 O2-·清除能力[7]。利用DPPH溶于乙醇后显紫红色，加入自由基清除剂后，由于孤对电子被配对从而发生褪色现象，从而评价制备MT对DPPH自由基清除能力[8]。

1.7 指标测定

1.7.1 MT含量测定

取20 μL MT 上清液，加入3 μL 20%（m/V）TCEP溶液、10 μL 1 mg/mL SBD-F 溶液和 75 μL、pH 10.5反应缓冲液（含1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA和0.8 mol/L KOH），混匀后50 ℃水浴反应30 min，加入10 μL、4 mol/L HCl终止反应。将混合体系采用 20 mmol/L、pH 7.5缓冲液定容至1 mL，混合均匀，经0.22 μm水系膜后，进行HPLC分析[9]。流动相：乙腈∶磷酸缓冲液（25 mmol/L，pH 7.5）∶甲醇体系=18∶80∶2；色谱柱：ODS-BP（Sinochrom，4.6 mm×250 mm，5 μm）C18柱；进样量：40 μL；洗脱时间：20 min；流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃；激发波长380 nm，发射波长510 nm；标准品：兔肝MT，保留时间：7.3～7.7 min。

1.7.2 金属含量测定

称取待测样品0.80～1.20 g，加入12 mL HNO3和3 mL HClO4，混匀后进行消解。电热消解程序：升温至100 ℃，保持30 min；至130 ℃，保持60 min；再升温至150 ℃，至消解完成；最后升温至180 ℃，赶酸至样品容量约2 mL。冷却至室温，超纯水定容50 mL，原子吸收分光光度计法测定各金属元素含量[10]。

1.8 数据统计与分析

采用origin 8.0、SPSS及Design Expert 8.0进行处理，实验数据均为3次平行实验的平均值，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与讨论

2.1 酵母发酵液的预处理

2.1.1 高温沉降法预处理效果

图1 加热温度对发酵液中MT（a）和离心沉淀（b）含量的影响Fig.1 Effect of temperature and holding-time of heating on content of MT (a) and sediment (b) in fermentation broth

由图1结果可知，酵母发酵液经50～60 ℃加热处理60 min，发酵液中MT损失率都在10%以内；30 mL发酵液经加热离心，获得沉淀含量范围为1.00～1.14 g。采用70～80 ℃高温处理40 min，发酵液中MT含量下降迅速。80 ℃条件下加热10 min，发酵液中MT损失率为4.55%，沉淀固形物含量范围为1.00～1.19 g；而加热时间超过10 min后，MT损失率迅速升高。研究表明，MT由于分子结构的特殊性，其耐热性十分突出，因此可利用短时、高温处理，去除发酵液大部分耐热性较差杂蛋白，同时也起到灭菌灭酶、减少后期纯化过程中对目的蛋白降解作用[11]。综合考虑，选择80 ℃加热10 min进行发酵液预处理，再以8000 r/min离心20 min，获得较低杂蛋白含量的酵母发酵液。

2.1.2 等电点沉降法预处理效果

在不同体积酸处理条件下，发酵液中MT及总蛋白含量波动较大，结果如图2所示。随着加酸量的不断增加，上清液中总蛋白含量呈先迅速降低后趋于平缓趋势，表明发酵液中大部分蛋白耐酸性差，可通过加酸后离心而去除。上清液中MT含量总体呈平缓趋势，仅在达到MT等电点时（加酸量42 μL）含量最低，说明MT对酸稳定性较强。在1 mL发酵液中加入30 μL 4 mol/L HCl时，总蛋白含量达到最低，此时MT损失率为6.47%。因此，在不改变MT稳定性条件下，可通过改变发酵液的酸度，使发酵液中杂蛋白在酸性条件下变性或达到等电点的方法去除部分杂蛋白，达到发酵液前处理中除杂的目的[12]。综合比较以上两种预处理方法，保证较低MT损失率、良好灭菌、灭酶及除杂效果，同时避免加入试剂对MT造成污染，并考虑到实际生产的经济性、安全性及简易性，本试验采用热处理法作为发酵液预处理方法：80 ℃条件下保温10 min后，常温8000 r/min离心20 min，取上清液为预处理后酵母发酵液。

图2 加酸处理对发酵液中MT和离心沉淀含量的影响Fig.2 Effects of the acidity on content of MT and sediment in fermentation broth

2.2 酵母发酵液中MT的膜分离效果

选用50 ku平板超滤膜处理后，获得发酵液中MT得率为94.29%，杂蛋白去除率为24.82%。由此，平板超滤可有效去除发酵液中残留的一些大分子量杂蛋白，并对发酵液进行高效浓缩。经HPLC测定，经50 ku平板膜超滤除杂浓缩液中MT浓度达1.77 mg/mL。

2.3 发酵液中MT的纯化效果

图3 DEAE-FF柱层析分离结果Fig.3 Column chromatography results of DEAE-FF

溶液中的带电溶质分子通过琼脂糖凝胶时，其与离子交换剂中带相同电荷的离子进行交换，从而达到分离目的。在溶液体系pH、上样浓度及流速、洗脱缓冲液等单因素优化基础上，获得最佳纯化工艺参数为：上样浓度0.60 mg/mL、pH 8.5上样流速1.00 BV/h；10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）洗脱杂蛋白，0.60 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）洗脱MT。经平板超滤后的酵母发酵浓缩液，经 DEAE-FF层析介质吸附及洗脱曲线，如图3所示。由结果可知，大部分的杂蛋白先被洗脱，MT活性成分后被洗脱，分离效果较好。

2.4 MT中Cu2+的脱除效果

图4 不同pH对MT中结合的Cu2+金属脱除率影响Fig.4 Effect of different pH on the removal rate of Cu2+combined by MT

EDTA对多数重金属均具有良好螯合效果，常用作消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。不同pH值的EDTA溶液，对MT（DEAE-FF柱层析纯化后）中结合的Cu2+脱除效果如图4所示。在酸性条件下，MT中结合的Cu2+易发生解离，部分Cu2+能有效被EDTA鳌合，达到脱除Cu2+的目的[13]。在pH在1.5～4.0范围内，MT中结合的Cu2+脱除率随pH上升而不断提高，而后逐渐趋于平缓；EDTA溶液在pH=6.0时，脱除率最高达到 61.90%。在该条件下，脱除MT中结合的Cu2+、SephadexG-25脱盐，冷冻干燥后获得MT纯化样品。

在MT纯化样品溶液中添加一定量金属元素，评价MT对金属元素的再吸附性能。结果发现，MT对Pb2+、Cr6+、Cd2+和Cu2+均具有一定再吸附能力，其中对 Cr6+吸附率为 75.70%；其次为 Pb2+，吸附率为62.10%；对Cd2+的吸附率为22.60%；对Cu2+的吸附率仅为12.40%，可能是因为原有MT分子中Cu2+的结合位点已接近饱和。综上，MT对金属元素的再吸附能力依次为 Cr6+＞Pb2+＞ Cd2+＞ Cu2+。

2.5 纯化MT对自由基的清除作用

MT是一种有效的自由基捕获剂，其在清除自由基同时会释放出微量金属元素，促使免疫功能和细胞代谢，从而提高机体抗炎及自我保护修复的能力。MT对OH·、O2-·和DPPH自由基的清除率，见图5。

图5 MT 对 OH·（a）、O·（b）和DPPH（c）自由基的清除率Fig.5 The removal rate of OH· (a), O· (b), and DPPH (c)radicals by MT

由结果可知，MT对H2O2-Fe2+体系（0.25 mL、0.20 mmol/L结晶紫，0.5 mL、1.00 mmol/L FeSO4，0.25 mL、0.02% H2O2混合体系）产生OH·自由基50%清除率量为 0.03 mg；对邻苯三酚溶液（7.5 μL、45 mmol/L）产生O·自由基50%清除率量为0.04 mg；对DPPH（4 mL、50 mg/L）自由基50%清除率量为0.09 mg。研究表明，MT具有较好的清除自由基能力，其主要是MT分子中金属离子的动力学非指向性和巯基的亲和性，使得MT在与亲电性物质发生反应，尤其是与某些自由基发生反应。MT清除OH·自由基能力是SOD的10000倍，而清除氧自由基的能力约是谷胱甘肽GSH的25倍，在体内可以作为补体抗氧化剂[14]。

3 结论

以CuCl2诱导毕赤酵母发酵表达 MT，针对培养发酵液采用高温加热沉淀预处理法减少其杂蛋白含量，再经平板膜超滤浓缩、DEAD-FF琼脂糖凝胶层析及EDTA螯合脱除Cu2+等纯化工艺，分离制备了具有再吸附金属离子及较好清除自由基活性的MT制品。本实验优化了酵母源MT的纯化工艺，但制备MT纯度仍不太高，后续将进一步对酵母发酵MT高纯化产品开发深入研究。