竹节参总皂苷改善高脂高糖饮食小鼠的神经炎症及可能的机制

王东帆，王瑞，袁丁，张长城，刘朝奇，袁成福，周志勇，何毓敏，顿耀艳，王婷

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌 443002）（2.三峡大学仁和医院，湖北宜昌 443001）（3.缺血性心脑疾病转化医学宜昌市重点实验室（三峡大学），湖北宜昌 443002）

随着人类生活水平的不断提高，人们日常食用的食物中含有大量的糖和脂肪等高能量成分，高脂高糖饮食在人们饮食结构中占有的比例成分越来越大，人们所熟知的是长期的高脂高糖饮食会导致肥胖、糖尿病和脂肪肝等代谢综合征疾病的高发病率。然而，高能量饮食也会对中枢神经系统产生较大的影响。据报道，长期高能量饮食可引起中枢神经系统病变，如产生阿尔兹海默症，认知功能障碍和抑郁症等神经退行性疾病；而中枢神经系统病变伴随着神经炎症的发生[1,2]。大量研究结果表明，高脂高糖饮食可诱导脑组织炎症反应的发生。如高脂高糖饮食可导致小鼠海马组织结构变化，使锥体细胞大量变性，并可显著增加小鼠脑组织中炎性因子表达[3,4]。

竹节参(Panax japonicus Rhizoma)是五加科人参属植物竹节参(Panax japonicus.C.A.Mey)的干燥呈竹鞭状根茎，其主要活性成分为竹节参总皂苷(Saponins of Panax Japonicus，SPJ)。现代药理研究表明竹节参具有良好的抗炎活性[5]，如袁丁等人研究发现竹节参总皂苷可显著对抗小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀模型的炎症反应[6]；竹节参总皂苷可改善LPS刺激的RAW264.7细胞炎症反应[7]。越来越多的研究表明竹节参总皂苷对中枢神经系统具有保护作用，且对神经炎症具有良好的抑制作用。Deng等人研究发现竹节参总皂苷能够显著抑制自然衰老大鼠所致的神经炎症反应[8]；另外，竹节参总皂苷对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用[9]。但是，竹节参总皂苷是否对高脂高糖饮食诱导的脑组织炎症反应有调节作用尚未见相关报道。因此，本实验以高脂高糖饮食为模型，研究竹节参总皂苷对脑组织炎症反应的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物及饲料

雄性Balb/c小鼠，SPF级，体重18～22 g，周龄为4～6周。三峡大学实验动物中心，动物生产许可证号（（SCXK）（鄂）2008-0005）。饲养于室温20～25 ℃、相对湿度50%～80%、明暗交替12 h/12 h环境，自由摄食饮水。高脂高糖饲料：按照53%普通饲料，20%果糖，5%胆固醇，20%猪油，1%食盐，0.25%胆酸钠的比例压制而成，并进行辐照灭菌处理。

1.1.2 药物及试剂

竹节参购于湖北恩施州宣安县椿木营竹节参种植基地，由湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定。根据课题组前期研究方法，取干燥竹节参药材粗粉，采用醇提法进行竹节参总皂苷的分离和纯化[10]。鼠单抗 iNOS（sc-7271），兔单抗ASC(sc-514414)，美国Santa cruz公司；兔多抗NLRP3（ab214185），兔多抗IL-1β（ab9722），美国abcam 公司；兔单抗 COX-2（#12282），兔单抗 β-actin（4970L），美国 cell signaling公司；鼠单抗 Caspase-1（NB100-56565），美国novus公司。山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗，武汉科瑞有限公司。其它所用试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

Power Pac200 western blotting电泳仪，美国Bio-Rad；EG1150H石蜡包埋机、TP1020自动脱水机、EG1150C超薄切片机，德国Leica公司；IX53显微镜，日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型与给药

将40只小鼠随机分为4组，即正常对照组、模型对照组、竹节参总皂苷低剂量组（16.7 mg/kg），竹节参总皂苷高剂量组（50 mg/kg），每组10只。分别给予普通饲料，高脂高糖饲料以及含相应剂量竹节参总皂苷的高脂高糖饲料，持续喂养4个月。

1.2.2 小鼠脑皮层组织HE染色

腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉小鼠，胸主动脉灌注生理盐水冲洗血液，然后灌注 4%多聚甲醛，断头取脑固定于4%多聚甲醛。脱水后，石蜡包埋组织，4 μm切片进行HE染色，镜下观察皮层部位神经细胞形态变化。

1.2.3 Western Blot检测小鼠脑皮层组织中相关蛋白的表达

检测NLRP3炎症小体、ASC、Caspase-1、iNOS和COX-2蛋白的表达。提取小鼠脑皮层组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，加入Loading buffer后95 ℃变性10 min。经SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，封闭，一抗4 ℃过夜。加入二抗室温孵育1 h，洗膜，ECL显影。

1.2.4 免疫组织化学法检测小鼠脑皮层组织中IL-1β和Iba-1蛋白的表达

小鼠脑组织切片常规脱蜡至水，高压抗原修复，3%H2O2室温10 min封闭内源性过氧化物酶，PBS冲洗，5%BSA室温封闭1 h，甩去多余液体，加一抗4 ℃过夜。PBS冲洗，二抗室温孵育1 h，PBS冲洗，镜下观察DAB显色。蒸馏水洗片，苏木素复染，脱水透明封片，镜下观察。

1.3 统计分析

Western Blot条带应用Image J软件进行灰度扫描分析，以样品各蛋白的灰度值与其内参β-actin的比值代表蛋白相对表达量。免疫组化用Image Pro Plus软件进行IOD扫描，用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计学分析，数据以¯x±s表示，各组均数用单因素方差分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠脑组织形态学的影响

脑组织皮层HE染色结果显示，正常对照组皮层神经细胞胞核清晰，仅有少量变性细胞。模型对照组皮层神经细胞排列散乱，且出现大量变性，细胞核固缩为三角形或不规则形状且呈深伊红色。给予竹节参总皂苷干预4个月后可明显改善神经细胞病理变化，结果如图1所示。

图1 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层神经细胞形态的影响（×400）Fig.1 Effect of SPJ on the morphology of cortical neurons in HFFD mice (×400)

2.2 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠脑皮层组织中小胶质细胞活化的影响

小胶质细胞是中枢神经系统内关键的免疫细胞，是对神经炎症免疫应答的主要神经细胞。有研究发现高脂饮食能够引起小鼠脑组织海马齿状回区小胶质细胞的活化及其数量的增多[11]，Iba-1抗体可特异性标记小胶质细胞。本研究通过免疫组化染色标记小胶质细胞，同样也发现高脂高糖饲料喂养的模型对照组小鼠脑皮层组织中小胶质细胞数量较正常对照组明显增多，经竹节参总皂苷的干预后，小鼠脑皮层中小胶质细胞数量显著减少。结果如图2所示。

图2 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层组织中小胶质细胞活化的影响（×400）Fig.2 Effect of SPJ on the activation of microglia in the cortex of HFFD mice (×400)

2.3 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层组织中炎性因子COX-2和iNOS蛋白表达影响

环氧合酶 2(cyclooxygenase，COX-2)是合成前列腺素过程中一个重要的诱导型限速酶，参与机体的炎症反应，其在正常状态下细胞内的活性极低，当炎症发生时会在神经元中呈现高表达水平。生理状态下，由神经胶质细胞表达的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)仅有少量表达，炎症发生时其活性增强并催化释放大量的 NO，产生神经毒性。这两种酶与炎症反应有密切关系。Western blot结果显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠脑皮层组织中COX-2和iNOS蛋白表达水平显著升高（p＜0.01或 p＜0.05），竹节参总皂苷干预后可显著减少 COX-2和 iNOS的蛋白表达水平（p＜0.05或p＜0.01），结果如图3所示。

图3 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层组织中炎性因子COX2和iNOS蛋白表达的影响Fig.3 Effect of SPJ on the expression of COX2 and iNOS in the cortex of HFFD mice

2.4 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层组织中NLRP3炎症小体相关因子表达的影响

NLRP3炎症小体是由模式识别蛋白NLRP3，接头蛋白即凋亡相关点状蛋白（ASC）和效应分子半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）组成，活化的 Caspase-1能进一步促进IL-1β的成熟与分泌，诱导神经炎症反应[12]。NLRP3炎症小体参与多种神经退行性疾病的发生与发展，与神经炎症反应关系密切。

Western blot结果所显示，与正常的对照组相比，模型的对照组皮层的组织中 NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的水平均显著地升高（p＜0.05）；竹节参总皂苷干预后可显著减少 NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达的水平（p＜0.05或p＜0.01），其结果见图4。

图4 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠NLRP3炎症小体相关因子表达的影响Fig.4 Effect of SPJ on the expression of NLRP3 inflammasome in HFFD mice

图5 竹节参总皂苷对高脂高糖饮食小鼠皮层组织中IL-1β表达的影响（×400）Fig.5 Effect of SPJ on the expression of IL-1β in the cortex ofHFFD mice (×400)

IL-1β免疫组化染色结果显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠皮层组织 IL-1β表达显著升高（p＜0.01）；竹节参总皂苷干预后可显著减少 IL-1β的表达水平（p＜0.01或p＜0.001），结果如图5所示。

3 讨论

小胶质细胞是中枢神经系统内关键的免疫细胞，是对神经炎症免疫应答的主要神经细胞。高脂高糖饮食可引起小胶质细胞活化并释放炎性因子引起神经炎症反应[13,14]。T Kaur研究发现高脂饮食使青年雌性大鼠海马和皮层组织中小胶质细胞显著增多，且显著上调iNOS、COX-2、IL-1β等炎性因子的蛋白表达水平[15]。J Yang等人研究发现高脂饮食8周小鼠下丘脑组织中小胶质细胞标记物Iba-1以及炎性因子IL-1β的蛋白表达水平显著升高，且高脂条件下培养的BV2小胶质细胞中iNOS、IL-1β的mRNA水平显著升高[16]。本研究发现，高脂高糖饮食四个月后小鼠皮层组织中变性细胞增多，小胶质细胞数量增加，且炎性因子iNOS和COX-2的蛋白表达水平显著增多；给予竹节参总皂苷干预后可显著改善小鼠脑皮层组织病理变化，减少小胶质细胞的数量，并减少炎症相关因子iNOS和COX-2的蛋白表达，这提示竹节参总皂苷能减轻高脂高糖饮食诱导的小鼠脑组织炎症反应。

大量研究表明，NLRP3炎症小体参与阿尔兹海默症、帕金森病等多种神经退行性疾病的发生发展[17,18]。有研究发现 BV2小胶质细胞神经炎症模型中炎性因子IL-1β的表达上调，同时NLRP3炎症小体蛋白表达量显著升高，给予 NLRP3炎症小体抑制剂后，可显著抑制BV2小胶质细胞的活化并减轻LPS所致的炎症反应[19]。JL Sobesky[20]研究发现短期高脂饮食可激活大鼠海马组织中的小胶质细胞，且 NLRP3炎症小体蛋白表达水平、IL-1β的mRNA水平显著升高。邓丽丽等[21]人研究发现竹节参总皂苷可显著下调自然衰老大鼠脑组织中NLRP3炎症小体及炎性因子IL-1β的蛋白表达水平，发挥神经保护作用。本实验结果显示，竹节参总皂苷能减轻高脂高糖饮食诱导的小鼠脑组织炎症反应，进一步的机制研究发现竹节参总皂苷可显著抑制NLRP3炎症小体、ACS、Caspase-1的蛋白表达，说明竹节参总皂苷可通过抑制 NLRP3炎症小体及其下游炎性因子的表达而抑制神经炎症反应。

4 结论

长期高脂高糖饮食使机体处于慢性炎症状态，我们的研究发现高脂高糖饮食可引起小鼠脑组织神经炎症反应，使皮层椎体细胞大量变性，小胶质细胞活化，炎性因子表达水平显著升高；经竹节参总皂苷干预后，高脂高糖饲养的小鼠脑组织炎症反应明显减轻，且NLRP3炎症小体及其下游炎性因子IL-1β的表达水平显著降低。因此我们得出结论：竹节参总皂苷可减轻高脂高糖饮食小鼠脑组织的炎症反应，其机制可能与抑制 NLRP3炎症小体的活化从而减少炎症相关因子的释放有关。本研究为高脂高糖饮食导致的中枢神经系统炎症反应的防治提供了新的思路。