超声处理制备小麦醇溶蛋白胶体颗粒Pickering乳液及其表征

吴滋灵，周福珍，尹艳，尹寿伟

（1.华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心，广东广州 510640）（2.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

Pickering乳液是一类由固体颗粒稳定的无皂（surfactant-free）乳液，其最大的优势是耐受聚并（coalescence）[1]。英国 Hull大学的 Binks教授对Pickering乳液的研究在理论上做出较大的贡献，建立了Pickering乳液的界面解吸能(ΔE)与三相接触角(θ)、颗粒半径(r)和界面张力(γ)之间的关系[2]。通常尺寸大于10 nm的胶体粒子的解吸能比热运动能(～kBT)大3个数量级以上，其界面吸附可认为是不可逆的[3]。无机颗粒稳定的Pickering最为传统，其形成机理、性能及微观结构研究最为深入。最近，胶体科学家开始探索新型Pickering乳液，如环境响应Pickering乳液、可逆的Pickering乳液。食品级Pickering乳液是食品胶体研究领域的热点和挑战，兼具活性物输送、低热量(calorie reduction)和质地改良(texture modification)的功能[4,5]。2013年，英国Leeds大学的Dickinson教授撰文指出探寻合适食品级 Pickering乳化剂是食品胶体领域的挑战[6]。英国Leeds大学的Murray教授在食品级Pickering乳液构建方面开展重要的探索工作，利用辛基琥珀酸淀粉颗粒构建了微米级的水包油型Pickering乳液，此类乳液能稳定数月[7]。比较而言，以食物蛋白颗粒制备的Pickering乳液的更具优势，也更具挑战。多数食物蛋白不能直接作为Pickering乳化剂，如大豆蛋白等通过界面吸附、展开和重排形成传统的乳液。针对这类蛋白质，可以通过热聚集、酶或化学交联合成蛋白胶体颗粒，以制备Pickering乳液。华南理工大学唐传核教授在大豆蛋白胶体颗粒稳定的Pickering乳液研究方面较为突出[8]。以自组装醇溶蛋白颗粒为乳化剂制备 Pickering乳液是食品胶体领域的前沿。我们研究小组利用zein胶体颗粒构建了稳定的食品级Pickering乳液，并通过界面输送制备出抗氧化的Pickering乳液[9]。

小麦醇溶蛋白(gliadin)是一类两亲性的疏水蛋白，溶剂极性改变会引发由两亲性驱动的gliadin分子自组装形成纳/微尺度的胶体颗粒。因此，小麦醇溶蛋白颗粒在构建食品级的Pickering乳液方面，具有广阔的前景。前期研究表明，不经过修饰的小麦醇溶蛋白颗粒制备的Pickering乳液只能稳定数天，通过静屏蔽途径调控 gliadin胶体颗粒表面润湿性，制备出稳定的Pickering乳液，并揭示了相关构效机理[10,11]。本研究利用超声的乳化以制备稳定Pickering乳液，系统研究了不同超声功率对Pickering乳液形成、稳定性、微观结构的影响，探讨了乳液微结构、流变学特性与乳液稳定性间的关系，为食品级Pickering乳液在新型营养物质输送载体及食品结构修饰基料应用提供了新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

1.1.1 材料

小麦谷朊粉、玉米油，市购；无水乙醇，购自南京试剂化学有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

超声乳化机，美国OMNI公司；高速剪切机(T10)、旋转蒸发仪记磁力搅拌器，德国IKA公司；冷冻干燥机，德国Christ公司；Zeta电位及纳米粒度仪Nano-ZS，英国Malvern公司；粒径分布仪（Mastersizer 3000），英国 Malvern公司；激光共聚焦显微镜，德国 Leica公司；HAKKE RS600流变仪，德国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦醇溶蛋白胶体颗粒的制备

小麦醇溶蛋白的提取参考 Duclairoir等报道的方法[12]，稍加改动。以市购谷朊粉为原料，经70%的乙醇提纯冷冻干燥后，得到小麦醇溶蛋白。采用经典的反溶剂纳米沉淀法制备小麦醇溶蛋白胶体颗粒[13]。将小麦醇溶蛋白溶解在70%（V/V）的乙醇中，得到2.5%（m/V）的溶液。在反溶剂过程，水/醇相体积比为2.5∶1。将小麦醇溶蛋白溶液缓缓倒入 1%冰乙酸的水溶液中，边倒边均质（6000 r/min 4 min）。所得悬浮液在 40 ℃水浴下旋蒸以除去乙醇和部分水，最后得到2.0%（m/V）小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）溶液。置于4 ℃冰箱冷藏，备用。

1.2.2 小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）的粒度和Zeta-电位的测定

采用Zetasizer Nano ZS测定胶体颗粒的粒度及电位。测量温度为25 ℃，颗粒分散系数为1.45，分散剂为水，水的分散系数（dispersant RI）为1.330。样品浓度为0.1～0.2%。

1.2.3 Pickering乳液的制备

以 2%（m/V）小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）作为乳液剂制备Pickering乳液。玉米油以油相，油水比为1∶1（V/V），用高速分散机IKAT10经20000 r/min均质2 min制备得到粗乳液。之后采用超声处理进行二次乳化，功率大小分别为0（对照）、20、40、60、80%和100。脉冲70%，超声时间6 min。

1.2.4 乳液的储藏稳定性

通过观察放置时间中乳析层的变化来评价乳液的稳定性。若乳析层不变，则说明乳液稳定性好；若乳析层不断改变，并伴随漏油破乳等现象，则说明乳液稳定性不好。使用Canon DIGITAL IXUS 110 IS照相机对乳液进行拍照。

1.2.5 乳液的粒径分布测定

采用 Mastersizer 3000粒度分布仪测定乳液的粒径及分布。以水为分散剂，颗粒折射率和吸收率分别为1.470和0.001，分散剂折射率：1.330。采用体积平均直径（D4,3）来表征乳液的粒度及分布。

1.2.6 乳液的微观结构：激光共聚焦显微镜（CLSM）观察

采用激光共聚焦显微镜(CLSM)研究乳液的微结构。样品染色方法是：1 mL样品中用40 μL尼罗红和尼罗蓝混合荧光染液染色；分别在488 nm激发尼罗红，在633 nm激发尼罗蓝；扫描频率100 Hz，扫描密度为1024×1024。使用LAS AF Lite软件进行图像处理。

1.2.7 乳液的流变学特性

流变学特性通过HAAKE RS600流变仪测定。乳液样品在测试过程中保持恒温 25 ℃，使用直径为27.83 mm的平板，其间隙为1 mm。

应力扫描：设置应力范围为0.1 Pa～1000 Pa，固定频率为1 Hz。

频率扫描：根据应力扫描结果，选择在线性粘弹区域进行频率扫描。本实验中应力为1 Pa，频率范围为 0.1 Hz～10 Hz。

1.2.8 数据统计与分析

所得结果均是取3次测量的平均值，且结果采用SPSS 13.0系统进行数据的显著性分析，显著性差异采用95%的置信区间进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）的Zeta-电位、粒度及外观

表1 小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）的粒径、多分散指数（PDI）和Zeta-电位Table 1 Size and zeta potentials of gliadin colloid particles(GCPs)

图1新制(a)和1 h后(b)小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）的外观Fig.1 Appearance photographs of the GCPs dispersions: (a)freshly prepared and (b) after one hour

表1给出了GCPs的粒径、多分散指数（PDI）、Zeta-电位的大小，图1给出了GCPs的外观。可以看到，GCPs粒子的PDI较大（0.755±0.113），呈多分散性分布；粒径为120.1±2.3 nm，Zeta-电位为24.25±1.55 mV。放置1 h后，小麦醇溶蛋白胶体颗粒仍呈半透明状态。分散液中胶体颗粒的稳定性主要是由整体核电荷决定的，在酸性环境(～pH 30)GCPs颗粒间的静电排斥力非常高，足以能够保证分散液的稳定。但是稳定的Pickering乳液的形成有赖于颗粒将的相互作用力，构建较为完整的界面结构。

2.2 Pickering乳液的储藏稳定性

图2 不同超声功率的Pickering乳液的外观Fig.2 Appearance photographs of the Pickering emulsions as a function of ultrasonic power

储藏稳定性是一个乳状液非常关键的品质参数。乳析是乳液聚集或聚并的先兆，储藏稳定性主要是通过乳析指数来评定。图2显示了不同超声功率下GCPs稳定的 Pickering乳液的外观性质。新鲜制备的乳液（图2a）是均匀的，没有出现乳析或分层现象。在储藏过程中由于重力的作用，乳液中的水层在下方，富含油脂的乳液在上方。超声功率为 0、20%的乳液在储藏3 d后便出现黄色小油滴，说明乳滴开始破裂，变得不稳定而漏油。而超声功率为40%、60%、80%、100%的乳液（图 2b）只是析出了少部分水（乳析指数在 20%左右），乳液没有出现漏油现象，也就是说乳液仍保持稳定。而且超声功率为40%～100%的乳液在储藏高达5个月之久后，仍保持稳定，而且可以实现倒置（图3）。这表明该乳液可能具有一定的粘弹性和凝胶特性，形成的乳液较为稳定。

图3 放置5个月后的Pickering乳液外观（功率为40%）Fig.3 Appearance photographs of the Pickering emulsions of 40% ultrasonic power after 5 months

2.3 Pickering乳液的粒径

图4 超声功率40%的GCPs稳定的Pickering乳液的粒径分布Fig.4 Size distribution of GCPs stabilized Pickering emulsions fabricated by 40% ultrasonic power as a function of time

从表2可以看出，新制乳液经过超声处理后平均粒径随着超声功率的增大而减小。超声功率在20%的乳液比不经过超声的乳液粒径减少了超过 50%以上（从10.7 μm减小到4.7 μm）。新制乳液超声功率为60%以上的乳液平均粒径在2 µm以内。

乳液在放置了两个月后，超声功率为0%和20%的乳液破乳（破乳无法检测粒径），这与之前乳液稳定性试验结果是一致的。而超声功率在40%以上的乳液粒径比新制乳液粒径稍微变大，但增大的幅度很小（大概增加了1 μm），乳液粒径保持在5 μm尺度内，一般低内相乳液的粒径在10 μm左右，且乳液的粒径越小，则表明乳液越稳定，所以本实验制备的超声乳液具有较强的储藏稳定性。图4是超声功率40%的乳液不同时间放置后的粒径分布图。从图中，我们可以明显地观察到，随着时间的增加，功率40%的乳液的粒径大小仍一致，且分布较均匀，这表明超声处理的乳液没有破坏乳液的结构，乳液在经过长时间的保存后，其结构具有较高的稳定性。

表2 不同超声功率下Pickering乳液的粒径大小Table 2 Droplet size of GCPs stabilized Pickering emulsions as a function of ultrasonic power

2.4 Pickering乳液的微观结构

图5 Pickering乳液的CLSM图（标尺：10 μm）Fig.5 Selected CLSM images (Scale bar: 10 μm) of GCPEs as a function of ultrasonic power

研究乳液的微观结构（如界面结构、颗粒分布、连续相网络结构等）有助于理解乳液的形成及乳液的稳定性。激光共聚焦显微技术（CLSM）能够清楚地观察到以上微观结构。图5显示出部分典型的超声处理后的GCPEs图像。绿色表示的是用尼罗红染色玉米油，红色表示的是用尼罗蓝染色小麦醇溶蛋白胶体颗粒（GCPs）。从图a我们可以观察到，不经过超声的乳液滴一颗一颗均匀分布，连续相中红色（蛋白质）明显，这表明上到油滴表明的蛋白质较少；而图b是超声功率为40%的乳液CLSM图，从图中可知，乳液油滴更小，而且呈现絮凝聚结状，这可能是因为经过超声处理后，超声过程输入的能量有助于更多的蛋白固体颗粒吸附到油水界面，从而稳定更多更小的油滴，而且乳液滴絮凝聚结明显但不合并，呈现如图所示的结构，表明该结构是稳定的。

2.5 Pickering乳液的流变学特性

由固体颗粒稳定的乳液通常情况下具有较好的流变学特性，对乳液的稳定性有重要的影响。本实验通过频率扫描和应力扫描表征乳液的流变学特性，其中，Gʹ和Gʹ分别表示弹性模量和粘性模量，两者的交点表示其临界应力（乳液在该作用点下发生凝胶-溶胶的结构转化）。图6是超声功率为80%乳液的应力扫描（a）和频率扫描（b）图。从图a中可看到，在线性粘弹区域内，Gʹ（4000 Pa）明显高于 Gʹ（640 Pa），这表明该乳液具有类似于固体的粘弹性能，继续加大压力到超过100 Pa，才出现临界交点，这表明乳液的粘弹性较强。从图中可知，该超声乳液的Gʹ在3500～4000 Pa范围内，而以往的研究表明，具有较好凝胶特性的高内相Pickering乳液的Gʹ在1000 Pa左右，这表明经过超声的乳液具有优异的稳定性，具有高内相乳液的粘弹性能和凝胶性。图b是超声功率为80%的乳液频率扫描图，从图中可知，Gʹ明显高于Gʹ，Gʹ表现出较弱的频率依赖性，且频率扫描的Gʹ在2500～3000 Pa之间，表现了乳液较强的凝胶特性，其频率扫描结果与其应力扫描结果一致。

从前面该乳液的激光共聚焦乳液结构分析中我们知道，油滴经过超声后被剪切为粒径更小的液滴，更多的蛋白颗粒吸附到油水界面上，而且由于蛋白颗粒对油滴的稳定作用，使得邻近的乳液滴絮凝粘结而不合并，油滴与油滴之间通过固体蛋白颗粒被固定下来，蛋白形成稳定的网络结构，而且由于油滴的固定使乳液失去流动性，因此在流变学特性实验中表现类固体的粘弹性和凝胶特性，使得乳液滴可以稳定很长时间。

图6 Pickering乳液（超声功率80%）的G'、G''随扫描频率和应力的变化Fig.6 Variations of storage (G') and loss (G'') moduli with the stress (a) and frequency (b) for the Pickering emulsionsproduced with 80% ultrasonic power

3 结论

3.1 本文利用反溶剂纳米沉淀技术制备出纳米尺度的小麦醇溶蛋白胶体颗粒(GCPs)，采用简单低成本的超声乳化制备出小麦醇溶蛋白稳定的Pickering乳液，放置5个月以上仍旧保持稳定。

3.2 本文初步探讨不同超声功率对乳液稳定性的影响，结果表明超声功率为40%以上的乳液具有小的粒径以及更好的稳定性；通过激光共聚焦（CLSM）研究蛋白颗粒、油滴在界面、体相的分布情况以及乳液的微观结构，结果表明经过超声处理，油滴被剪切为更小的液滴，超声过程中输入的能量有助于蛋白颗粒的吸附，更多的蛋白颗粒吸附到油水界面从而稳定界面，且蛋白形成稳定的三维网络结构，油滴絮凝聚结而不合并，赋予了乳液更优异的稳定性、流变学的性能。