异氟烷预处理对大鼠心肌缺血再灌注炎症因子在TLR4/NF-κB通路调节中的作用

李 岚，芦 曼，陈永权

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 麻醉科，安徽 芜湖 241001;2.芜湖市妇幼保健院 麻醉科，安徽 芜湖 241000)

随着人口的老龄化，心血管缺血性疾病已成为严重危害人类健康和生命的一大疾病。近年来，心脏外科手术数量呈直线上升趋势，目前认为吸入性麻醉剂异氟烷对手术导致的心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。本课题组研究证实[1]，异氟烷预处理可以抑制TLR4/NF-κB信号通路，从而对大鼠缺血再灌注损伤的心肌起到保护作用,但异氟烷是如何通过TLR4/NF-κB通路调节对心肌的保护尚不得而知。有研究表明[2-3],通过使用某些药物直接作用于TLR4/NF-κB通路，发现其与一些炎症疾病的治疗有关联性，为TLR4/NF-κB信号通路与组织细胞的抗炎免疫具相关性提供了佐证。本研究旨在探讨异氟烷预处理是否通过TLR4/NF-κB信号通路来调节心肌缺血再灌注时炎症因子的表达而起到心肌保护作用，为异氟烷进一步研究提供新的导向。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康Sprague Dawlay大鼠32只，雄性，体质量280～320 g，购自南京市青龙山实验动物养殖公司。大鼠分笼饲养，笼内温度维持在18～22℃，周围环境12 h昼夜交替。

1.2 动物分组 32只大鼠随机分为4组。对照组1组，即缺血再灌注损伤组(IR组)，实验组3组，分别为：异氟烷预处理组(I组)、TAK-242预处理组(T组)及联合预处理组(I+T组)，每组8只。IR组：单纯建立缺血再灌注模型；I 组：吸入浓度为1.0 MAC 的异氟烷30 min，接着吸入浓度为30%的氧气15 min，然后行缺血再灌注；T 组：参照文献[4]，经尾静脉注射TLR4抑制剂TAK-242(10 mg/kg)，然后行缺血再灌注；I+T 组：尾静脉注射TAK-242(10 mg/kg)，1 min后吸入浓度为1.0 MAC的异氟烷30 min，再吸入浓度为30%的氧气15 min，然后行缺血再灌注。

1.3 模型制备 实验前，各组大鼠禁食8 h，可自由饮水，采用1% 戊巴比妥钠5 mL/ kg 进行腹腔麻醉，仰卧位固定，气管切开插管后接动物呼吸机(北京众实迪创)控制呼吸，持续监测大鼠心电活动。在左侧第3、4 肋开胸，钝性分离，充分暴露心脏，剪开心包膜，采用6-0的无损伤缝线在平左心耳下缘偏左1～1.5 mm 处进针，穿过包绕左前降支后出针，充分拉紧结扎线结，出现左心室发绀苍白，心电图显示ST段弓背样抬高等表现，以达到心肌缺血目的。结扎30 min后,剪断缝合线，恢复心肌灌注120 min。等到灌注结束，抽取股动脉血2～3 mL，4℃3000 r/min离心15 min，把血清液分离，置于-20℃环境保存备用，再处死大鼠，取各组心尖区的心肌待测。除掉模型制备过程中心肌缺血前心电图异常以及实验未结束就死亡的大鼠。

1.4 观察指标 ELISA法测血清IL-6和TNF-α的含量，Western-blot测定心肌组织NF-κB和Caspase-3蛋白的表达。

1.5 统计学处理 应用SPSS 18.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠IL-6和TNF-α表达的比较 与对照组比较，各实验组IL-6和TNF-α的表达均下降(P<0.01)；与T组比较，I组IL-6和TNF-α的表达上升 (P<0.01)，I+T 组IL-6和TNF-α的表达下降(P<0.01)，见表1。

2.2 各组大鼠NF-κB和Caspase-3表达的比较 与对照组比较，各实验组NF- κB 的表达均下降(P<0.01)；与T、I+T 组比较，I 组NF-κB 的表达降低(P<0.01)。与对照组比较，各实验组Caspase-3的表达均下降(P<0.01)；I组和T组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠IL-6、TNF-α、NF-κB及Caspase-3表达的比较

分组nIL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)NF-κBCaspase-3IR 组8102.32±3.13170.02±1.781.646±0.0111.52±0.05I 组880.60±2.02∗#130.89±2.14∗#1.126±0.004∗1.31±0.06∗T 组862.43±2.11∗106.37±3.61∗1.340±0.009∗△1.37±0.04∗I+T组838.86±1.42∗#87.56±3.49∗#1.238±0.007∗△1.08±0.04∗F985.3481093.7694611.343104.781P0.0000.0000.0000.000

注：*与IR组比较，P<0.01；#与T组比较,P<0.01；△与I组比较,P<0.01。

3 讨论

异氟烷作为常用的吸入性麻醉剂，具有溶解度低、诱导和苏醒迅速的特点，对心肌无明显抑制，且肌松良好，临床应用广泛。异氟烷对心肌保护[5]研究显示,异氟醚后处理诱导的心肌保护作用可能是由NO介导，通过激活PI3K-PKB/Akt途径实现的；Krolikowski等[6]表明异氟醚后处理是依赖激活mitoKATPC途径进而阻断线粒体通透性转换孔的开放发挥心肌保护作用的。

NF-κB是真核细胞转录因子Rel家族成员之一，它可以调控炎症介质的释放，参与细胞凋亡，从而影响心肌缺血再灌注的病理生理过程。一方面，心肌缺血再灌注后，由于氧化应激、内质网钙离子超载、氧自由基、NO、内毒素等多种因素，导致NF-κB被激活,调控众多炎症介质如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1、巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)、E-选择素(E-selectin)等基因的表达量增加，诱发心肌的炎症反应；另一方面，NF-κB可以激活如Fas、Fasl等促凋亡因子，从而诱导细胞凋亡。研究指出[7-9]，抑制NF-κB的活性可以抑制促凋亡Caspase-3蛋白的表达，上调抗凋亡基因如Bcl-2的表达，从而发挥抗细胞凋亡的作用。因此认为NF-κB是调控凋亡基因表达的重要的核转录因子。

本研究中使用的TAK-242是一种新型的TLR4信号通路抑制剂，其分子量小，在组织中分布迅速，能直接结合TLR4胞内区域，抑制由脂多糖诱导的炎症介质的产生。研究结果显示：较IR组，使用TAK-242后炎症因子TNF-α和IL-6的表达下降，Caspase-3表达减少，说明抑制TLR4/NF-κB信号通路能够下调TNF-α和IL- 6等炎症因子的表达，减少促凋亡Caspase-3蛋白表达。TLR4/NF-κB 信号通路参与了异氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[1]，而I组TNF-α、IL-6及Caspase-3的表达均降低，说明异氟烷作用于TLR4/NF-κB这条通路，也是通过下调TNF-α和IL- 6等炎症因子的表达，减少Caspase-3蛋白表达发挥心肌保护作用的。

与T组相比较，I组TNF-α和IL- 6的表达升高，这可能和本研究中所使用的TLR4抑制剂TAK-242有关系。异氟烷可能主要抑制了TLR4/NF-κB这一条通路，而TAK-242能够抑制包括TLR4/NF-κB信号通路在内的多条通路，使其下游的炎性因子TNF-α和IL-6的表达减少，故在本实验中T组TNF-α和IL-6的表达低于I组。I+T组两者表达最低，说明异氟烷预处理和TLR4抑制剂TAK-242抑制炎症反应的效应可以叠加。

从本实验结果看，与T组比较，I 组NF-κB 的表达降低,但促凋亡Caspase-3蛋白的表达，两组之间差异无统计学意义，这可能跟本实验所采用的测定NF-κB 的方法和试剂有关。NF-κB家族包含5个组分,本实验仅仅检测了其中一个亚型P65蛋白的含量。异氟烷可能主要抑制了P65NF-κB，而TAK-242主要抑制的是其他亚型。

综上所述，在心肌缺血再灌注损伤中，TLR4/NF-κB通路通过促进TNF-α和IL-6等炎症因子的释放，上调凋亡调节蛋白Caspase-3的表达而发挥重要的作用，而异氟烷预处理则是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来调节炎症因子的表达实现对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。