GCMS结合电子鼻检测微生物脂肪酶对乳品风味的影响

白 雪,杨 爽,孟 鑫

(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁省肉类工程中心,辽宁锦州 121000)

随着社会的发展,乳品行业在我国占据着重要的地位,其中奶贝和酸奶的生产和消费受到人们的广泛关注。乳品在经过发酵或加工处理时会产生挥发性风味物质成分,这主要是因为乳在加工过程中会发生复杂的化学反应从而形成风味,这些反应包括蛋白质和脂质的分解、糖的降解、氨基酸与化合物间的反应以及各种反应之间的相互作用,而这些风味成分很大程度上来源于脂肪酶、肽酶和蛋白酶等风味酶[1],尤其是脂肪酶。脂肪酶能够将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸,常广泛应用于油脂加工、食品、药品、环境治理等方面[2],是重要的工业酶制剂品种之一,普遍存在于动物、植物和微生物组织中[3]。在乳品加工过程中添加脂肪酶能增强乳品风味,例如,近年来有研究在赛达干酪生产中加入米曲霉可使干酪风味明显增强,成熟期也由几个月缩短到几小时;张硕[4]从猪肉脂肪组织中提取了内源性脂肪酶并添加到乳品中,经鉴定能够有效改善乳品风味。

然而,改善乳品风味是添加外源性脂肪酶,还是内源性脂肪酶,研究尚处于探索阶段。为此,本课题向奶贝和酸奶中添加微生物脂肪酶,利用电子鼻[5-8]采集添加微生物脂肪酶处理前后两种样品中的风味香气,并利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)[9-12]检测奶贝和酸奶中风味物质的变化情况,以期为风味乳制品的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

微生物脂肪酶 是从土壤中筛选的一株真菌产脂肪酶,在30 ℃、pH为5的条件下采用发酵培养基发酵3 d制得,发酵液中脂肪酶活力测定采用改进的铜皂法[13]测得酶活为7.6 U/mL,由本实验室提供;奶贝(固体块状)、酸奶(凝固型) 辽宁锦州某超市;其他试剂 均为国产分析纯;发酵培养基 蔗糖0.5 g,胰蛋白胨2 g,K2HPO40.1 g,MgSO40.05 g,(NH4)2SO40.1 g,1 mL橄榄油,定容至100 mL,115 ℃,灭菌15 min。

气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 公司;75 μm CAR/PDMS SPME萃取头 上海楚定分析仪器有限公司;PEN3电子鼻 德国AIR SENSE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 电子鼻检测挥发性物质 取上述两份发酵酶液10 mL分别与1 g奶贝、10 g酸奶搅拌混合均匀,在4 ℃、pH6条件下静置30 min为酶液处理组,另一组为未添加微生物脂肪酶的样品,两组分别取10 mL混合液放入烧杯中,迅速加盖密封,20 min后开始测量,两组样品重复测定两次。该实验中电子鼻信号的采集时间定为50 s,清洗时间为120 s。PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述见表1。

表1 PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensor

1.2.2 HS-SPME-GC-MS分析测定挥发性物质 准确称取奶贝溶液和酸奶溶液各5 mL置于20 mL顶空瓶中,加入3 mL氯化钠溶液和磁转子,迅速用聚四氟乙烯隔垫密封,于磁力搅拌器中45 ℃加热平衡10 min,用已活化好的75 μm CAR/PDMS SPME萃取头(270 ℃活化30 min)顶空吸附30 min后,将萃取头插入气质进样口,解吸5 min。每个样品重复测定两次。

色谱条件:HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气He,流速1 ml/min;进样口温度为270 ℃;程序升温:柱初温57 ℃,保持3 min,以4 ℃/min升温至260 ℃,保持10 min;分流比5∶1。

质谱条件:色谱-质谱接口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,电子能量70ev,四级杆温度150 ℃,质量扫描范围为30～550(m/z)。

1.3 数据处理

电子鼻数据分析:取稳定后第47～49 s间的数据信息进行主成分分析(PCA)。

GC-MS数据分析:挥发性成分通过计算机检索与Nist和Wiley标准质谱库匹配进行定性分析;采用峰面积归一化法进行定量计算出各挥发性成分的含量。

2 结果与分析

2.1 电子鼻检测微生物脂肪酶对奶贝风味的影响

从图1A、B可以看出,经过微生物脂肪酶处理的奶贝和未经过微生物脂肪酶处理的奶贝在风味轮廓上存在着明显的差异,添加微生物脂肪酶的奶贝香气比未添加微生物脂肪酶的奶贝香气变化明显,从图中可以看出R2、R7、R9传感器的响应值变化明显,说明经过微生物脂肪酶处理后,奶贝中的氮氧化合物R2、硫化物R7、芳香成分和有机硫化物R9含量有所增加,这就说明经过微生物脂肪酶酶解后产生了更多的挥发性成分,可在一定程度上有效提高奶贝香气,改善奶贝风味。

采用主成分分析(PCA)方法对微生物脂肪酶处理前后奶贝中的挥发性风味物质进行分析,如图1C所示,图中的横、纵坐标分别表示PCA的第一主成分的贡献率和第二主成分的贡献率,贡献率越大,说明主要成分可以较好地反映指标信息[14-15]。其中,第一主成分的方差贡献率为99.921%,第二主成分的方差贡献率为0.075%,贡献率总和大于95%以上,说明PC1和PC2可以代表奶贝样品挥发性风味的主要特征。从微生物脂肪酶处理的奶贝样品与未处理的奶贝样品之间的距离来看,经过微生物脂肪酶处理的奶贝样品的距离变远,说明处理后奶贝的气味成分差异显著。从图中可以看出,代表空白样品的信息采集点位于效果图左边,代表添加微生物脂肪酶的样品的信息采集点向右移动,电子鼻刚好能区分两样品。结论表明,通过主成分分析方法能有效的区分添加及未添加微生物脂肪酶奶贝样品的风味特征。

图1 电子鼻检测经微生物脂肪酶处理前后的奶贝样品Fig.1 Electronic nose detection of microbial lipase before and after treatment of milk samples注:A:未经微生物脂肪酶处理的奶贝;B:经微生物脂肪酶处理的奶贝;C:酶处理前后奶贝的PCA图。

2.2 电子鼻检测微生物脂肪酶对酸奶风味的影响

电子鼻检测微生物脂肪酶处理前后传感器响应变化曲线如图2A、B所示,两样品经过传感器,每条曲线的位置相似,只是相对电阻值的大小发生了改变,说明部分物质在含量上有不同程度的变化。添加微生物脂肪酶的酸奶的香气比未添加微生物脂肪酶的酸奶的香气变化明显,响应值变化较为明显的传感器分别是R2、R7、R9,说明经过微生物脂肪酶处理后,酸奶中的硫化物R7、芳香成分和有机硫化物R9、氮氧化合物R2均有所增加,这说明在酸奶中添加微生物脂肪酶能对酸奶风味的改善有一定的作用。

采用PCA(主成分分析)方法对微生物脂肪酶处理前后酸奶中的挥发性物质进行分析,见图2C,图中的每个椭圆代表同批次酸奶风味的数据采集点。通过图2C可以看出,两样品分布在图中的不同位置,说明添加及未添加微生物脂肪酶的酸奶在香气上存在着差别,电子鼻可以很好的将两者区分。其中,第一主成分的方差贡献率达到99.54%,PC1和PC2贡献率之和达到99.99%,能较好地反映数据信息,说明PC1和PC2可以代表酸奶样品挥发性风味物质的主要特征。这表明通过PCA方法能有效的区分添加及未添加微生物脂肪酶酸奶样品的风味特征。

图2 电子鼻检测经微生物脂肪酶处理前后的酸奶样品Fig.2 Electronic nose detection before and after microbial lipase treatment of yogurt samples注:A:未经微生物脂肪酶处理的酸奶;B:经微生物脂肪酶处理的酸奶;C:酶处理前后酸奶的PCA图。

2.3 HS-SPME-GC-MS测定结果

采用HS-SPME-GC-MS检测出微生物脂肪酶处理后奶贝,酸奶两种样品的挥发性化合物分别为32种和39种,主要为醛类、醇类、酸类、酮类、氮氧化合物等。与未经过微生物脂肪酶处理的两种样品相比,经过微生物脂肪酶处理的两种样品,其醛类化合物、醇类化合物、酸类化合物、酮类化合物的相对含量增加明显,如图3所示,由此可见,这些挥发性风味物质与乳品风味的形成密切相关。

2.3.1 醛类化合物 醛类化合物是乳制品中重要的风味物质之一,属于不稳定的中间体化合物,在一定条件下易被还原成相应的醇,是各种氧化风味的来源[16]。从图3可以看出,未处理的奶贝和酸奶挥发性成分中醛类物质的相对含量为6.59%、0.51%,经过微生物脂肪酶处理的奶贝样品中检测出的醛类物质的相对含量为7.75%,酸奶样品中检测出的醛类物质的相对含量为7.67%,可以得知两种样品检测出的醛类物质的相对含量均比原样品高,由于这类化合物的阈值较低,因而仍是奶贝和酸奶风味物质中不可缺少的一部分。奶贝和酸奶中的醛类化合物来源于脂肪酸代谢、氨基酸转氨作用或Strecker降解。酸奶和奶贝中检测出的壬醛一般具有青草味。

2.3.2 酮类化合物 酮类化合物风味独特,阈值低,乳制品中最重要的挥发性物质是甲基酮类物质,它们会赋予奶贝和酸奶水果、花香等香气风味物质。由图3可知,未处理的奶贝和酸奶中的酮类物质的相对含量为0.21%、2.92%,经过微生物脂肪酶处理的奶贝和酸奶样品中的酮类化合物的相对含量分别为0.27%、3.7%,从而可以看出,两种样品检测出的挥发性成分中酮类物质的相对含量均比未处理的样品中酮类物质的相对含量高。奶贝中检测出的2-庚酮具有类似梨的水果香味,酸奶中检测出的2-壬酮具有新鲜味,Tuba等[17]指出壬酮对酸奶产生的风味具有一定贡献。虽然酮类化合物在两种样品中的相对含量较低,但对风味的形成也具有不可忽视的作用。

图3 两种样品中挥发性化合物的相对含量Fig.3 The relative content of volatile compounds in both samples

2.3.3 酸类化合物 酸类化合物在乳制品中主要表现在滋味上,气味上表现不明显,本实验中经过微生物脂肪酶处理的奶贝和酸奶检测出的酸类物质的相对含量为4.53%、9.76%,而原样品中的酸类物质的相对含量分别为3.89%、0.73%,由此可以看出,经过处理的两种样品检测出的酸类物质的相对含量比原样品检测出的酸类物质的相对含量高,其中酸奶样品中辛酸的相对含量变化最明显,它是重要的挥发性风味香气的组成部分,表现出奶油香味,这说明微生物脂肪酶可以水解脂肪酸并释放出具有特征的脂肪酸,对增强乳品香气具有一定的作用。

2.3.4 醇类化合物 醇类化合物是乳品中比较普遍存在的风味物质,它主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不饱和脂肪酸衍生而来的。由图3可以看出,添加微生物脂肪酶的奶贝中醇类物质的相对含量为7.98%,酸奶中醇类物质的相对含量为10.97%,而原样品中的醇类物质的相对含量分别为0.26%、0.9%,由此可知,这两种样品中醇类物质的相对含量都要高于原样品中醇类物质的相对含量,这可能是由于脂肪酶参与脂肪的水解及氧化反应,水解产物能有效提高乳品原有的风味,所以醇类化合物对乳品风味的形成也极为重要。

2.3.5 其它化合物 酯类化合物在乳品中主要是通过脂肪酸水解和微生物代谢产生,除了能够赋予奶贝和酸奶类似花果香外,还可能缓和因碳链脂肪酸浓度过高所带来的刺激性味道,从而赋予奶贝和酸奶更加柔和的香气。经微生物脂肪酶处理后两种样品检测出的酯类化合物的相对含量变化不明显,但它仍对乳品风味的形成有着重要的作用。

微生物脂肪酶处理前后两种样品中检测出的烷烃类化合物对乳品风味影响不大,但它们是形成乳品风味有贡献的重要中间体,对形成乳品的奶香具有不可忽视的基底作用。

奶贝和酸奶样品经过微生物脂肪酶处理前后通过电子鼻检测可以看出氮氧化合物、硫化物、芳香成分和有机硫化物等含量有所增加,GC-MS检测可以看出醛类化合物、醇类化合物、酸类化合物、酮类化合物的相对含量比未处理的样品的相对含量高。由此可以看出,微生物脂肪酶在一定程度上能改善奶贝和酸奶的风味,使其风味更加浓郁,这为进一步进行乳制品风味的研究提供了一定依据。

3 结论

电子鼻检测可以很好的区分添加微生物脂肪酶处理前后奶贝和酸奶中挥发性风味物质成分的含量变化;PCA分析方法能说明微生物脂肪酶酶解后产生的挥发性成分有效的提高了奶贝和酸奶原有的风味。经GC-MS检测微生物脂肪酶处理的奶贝和酸奶中的挥发性物质成分主要为醛类、醇类、酸类、酮类、氮氧化合物等,这与电子鼻检测的结果一致,这进一步说明了微生物脂肪酶对改善乳品风味具有不可忽视的贡献作用。