细颗粒物对斑马鱼胚胎发育的影响

吴德生王宏辉袁建辉 2*王宏菊赵琼辉刘建军

（1．深圳市疾病预防控制中心毒理研究所，现代毒理学重点实验室，广东 深 圳 518055；2．深圳市南山区疾病预防控制中心，广东深圳 518054；3．深圳市出入境检验检疫局，广东 深 圳 518045）

细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)是空气动力学直径小于2.5 μm的颗粒，其粒径小，比表面积大，易于富集空气中的有毒有害物质，并可以随着人的呼吸进入体内，甚至进入人体肺泡或血液循环系统，直接导致心血管、呼吸系统等疾病，是大气环境中化学组成成分最复杂、危害最大的污染物之一[1-2]。当前，PM2.5污染已成为突出的大气环境问题，引起全世界各国的广泛关注。

长期处在雾霾天气中，人体吸入越来越多颗粒物，附于其上的有毒有害物质不断地随着血液进入人体，会对雌性或雄性的性腺产生直接或间接的毒性效应，人群中不育、性功能异常、月经周期紊乱等生殖功能发生异常的压力也随之增加[3-4]。然而，目前我们对雾霾细颗粒物对胚胎发育的危害作用及其机制并不十分清楚。因此，本文以模式生物斑马鱼胚胎为研究模型，探讨雾霾细颗粒物对胚胎发育的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

TH-1000 CII智能大容量空气细颗粒物(PM2.5)无碳刷采样器，购于武汉天虹仪表有限责任公司；石英滤膜购于美国Whatman公司；斑马鱼饲养系统购于北京爱生科技发展有限公司，HF212uv CO2培养箱购于上海力新仪器有限公司，体式显微镜购自德国Leica显微系统贸易有限公司。

1.2 斑马鱼

AB系斑马鱼，由深圳市疾病预防控制中心现代毒理学实验室自有AB系种鱼繁殖提供。饲养于斑马鱼饲养系统，光照周期14 h/10 h明暗交替，每天投食1次，挑选体长(3±1) cm的成年、健壮斑马鱼进行实验。

1.3 斑马鱼胚胎收集

选择发育良好的5月龄性成熟斑马鱼18尾。雌雄各9尾分别放入3个交配盒，每盒雌雄各3尾，雌鱼和雄鱼分别置于交配盒隔离板两侧。隔离过夜后，给予光照刺激产卵，同时撤去隔离板，10～30 min后，将成鱼转移回饲养系统，收集交配盒底部胚胎，于培养箱中备用。

1.4 PM2.5样品采集

选择雾霾天气进行采样，采样点位于深圳市某小学楼顶无遮挡区域，用细颗粒物采样器采集大气细颗粒物。采样时间为24 h ，连续7 d ，采样体积为1.3 m3/min。

1.5 PM2.5样品前处理

将载有颗粒物的滤膜剪裁成2 cm×2 cm，浸入去离子蒸馏水中，超声振荡3 次，每次20 min，洗脱颗粒物。振荡液经6 层纱布过滤，滤液于4 ℃、14 000 r/min 离心30 min (半径2.5 cm)，收集下层悬液冷冻真空干燥，低温冰箱保存备用。临用前用斑马鱼饲养用水配制成相应浓度，振荡使颗粒物充分混匀。

1.6 斑马鱼胚胎PM2.5暴露

将收集到的240个受精后2 h 的斑马鱼胚胎随机分为6组，每组40个，分别暴露于0、5、20、80、320、800 μg/mL的PM2.5混悬溶液中，混悬液随浓度的增加而浊度增加，在暴露后2、4、6、8、16、24、48、72、96 h分别在体式显微镜下计数胚胎孵化和死亡情况。

1.7 数据处理

实验结果以x±s表示。实验组与对照组间指标差异采用SPSS 19.0软件单因素方差分析方法处理，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 雾霾细颗粒物对斑马鱼死亡率的影响

如图1所示，与对照组相比，各剂量组在暴露后4 h开始出现胚胎死亡的现象，80、320、800 μg/mL剂量PM2.5混悬溶液组胚胎在暴露后48 h开始出现大量的死亡，320、800 μg/mL组死亡率达到100%。经过统计分析，PM2.5对斑马鱼胚胎的半数致死量为(56.6±2.8)μg/mL。

图1 雾霾细颗粒物对斑马鱼胚胎发育的影响

2.2 雾霾细颗粒物对斑马鱼胚胎孵化率的影响

如图2所示，与对照组相比，斑马鱼胚胎在雾霾细颗粒物暴露48 h后，随着剂量的升高，胚胎孵化率逐渐降低。暴露72 h后，只有对照组孵化率达到100%，而800 μg/mL剂量组无一粒胚胎孵化。

图2 雾霾细颗粒物对斑马鱼胚胎孵化率的影响

如图3所示，斑马鱼胚胎通常于受精后48 h左右开始孵化，随着细颗粒物暴露的浓度增加，胚胎出现不能孵化或者死胎现象也随之增高，其中80 μg/mL组有较多胚胎出现了不出膜现象。

3 讨论

图3 细颗粒物暴露后斑马鱼胚胎的变化(×30)

2013年1月在雾霾污染最严重的京津冀区域共计发生5次强霾污染过程，整个1月份共计22 d PM2.5小时浓度超过国家拟于2016年实施的环境空气质量标准的二级标准(75 μg/m3)，其中PM2.5最高值一度达到680 μg/m3，远高于“重度污染”的界限[5]。据辽宁省环保厅发布的数据显示[6]，2015年11月8日，沈阳市遭遇6级严重雾霾污染，全市PM2.5均值一度达到1 155 μg/m3，局地雾霾指数一度突破1 400 μg/m3，居当日中国重点城市空气污染首位。深圳市2014—2015年间，轻度污染发生天数占比19%。如此多发的雾霾天气引发了民众对健康的担忧，尤其是雾霾对生殖健康的影响也成为民众关注的焦点之一。

有研究发现。大气PM2.5污染与人类生殖功能的改变显著相关。Rogers等[7]的调查显示极低体质量儿与母亲暴露于二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)和总悬颗粒物(total suspended particulate，TSP)的量存在明显的相关性。Dugandzic等[8]发现空气污染可能会增加新生儿低体质量的风险，这种影响以妊娠第1个月及最后两周最明显。PM2.5浓度与婴儿低出生体质量、宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)及先天性功能缺陷具有显著统计学意义。BELL等[9]分析出生体质量不足(低于2 500 g)的因素表明：孕期暴露于PM2.5中，其浓度每增加1个4分位差(2.2 g/m3)，婴儿出生体质量就下降14.7 g(95%CI：12.3～17.1 g)。出生体质量不足与中期(14～26周)暴露于PM2.5有关。PM2.5对黑人母亲后代的危险性大于白人母亲的后代，显示出明显的种族效应。Dejmek等[10]对PM2.5浓度较高的波希米亚褐煤盆地的一组孕妇进行研究发现，对于中等浓度的PM2.5暴露孕妇出现IUGR的OR值为1.26(0.81～1.95)，而高浓度(＞37 μg/m3)为2.11(1.20～3.70)，表明中、高浓度的细颗粒物污染可能会影响胚胎发育。

目前，有关PM2.5动物实验的研究多集中于呼吸系统的危害，较少涉及生殖系统。本研究以斑马鱼为模式生物，研究PM2.5对斑马鱼胚胎发育的影响。正常情况下，斑马鱼胚胎在受精后48 h左右即可开始出膜孵化，以一定浓度PM2.5暴露于受精后的斑马鱼胚胎，其发育受到显著的影响。本研究中，对照组48 h孵化率可达到72.5%±3.2%，PM2.5暴露组的孵化率则随着PM2.5浓度的升高而降低，在各剂量组中可观察到胚胎死亡现象。当PM2.5暴露时间达到72和96 h后，对照组胚胎全部孵化，但在各暴露组中，不但有胚胎死亡现象，还有部分胚胎处于出膜前状态，不能孵化。经过相关回归分析，PM2.5对斑马鱼胚胎的半数致死量为(56.6±2.8) μg/mL。胚胎死亡率、孵化率是观察胚胎发育的重要指标，本研究的结果显示，PM2.5对斑马鱼的胚胎死亡率、孵化率均有影响。因此，PM2.5污染会导致胚胎发育受到影响。

雾霾已成为突出的大气环境问题，引起全世界各国的广泛关注。PM2.5会影响斑马鱼胚胎的发育，造成胚胎死亡率增加，孵化率下降，因此，研究其毒性，探索其效应机制已刻不容缓。