纳米颗粒诱导肝脏毒性的研究进展

王 晗倪 娟 周 滔 杨国防 汪 旭*

( 1．云南师范大学生命科学学院，云南 昆 明 650500；2．云南师范大学生物能源持续开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆 明 650500；3．上海三誉华夏基因科技有限公司，上海 201100 )

纳米颗粒(nanoparticles，NPs)，是指直径小于100 nm的微粒。纳米级的颗粒较正常颗粒(fine particle)而言，具有不同的理化特征，如表面积与体积比增大，活性位点、电荷和形状改变，表面衍生性增加，光催化活性增强，热性能更为优越等。目前，NPs已广泛运用到电子工业、食品产业、建筑材料、纺织品、医疗器械和药物、个人护理用品如防晒霜等领域[1]。随着人类越来越多的暴露在含NPs的用品中，NPs对人的健康风险评估已成为研究热点[2]。研究已证实，NPs对人类健康存在威胁，纳米氧化锌、二氧化钛、氧化铜、碳纳米管、碳富勒烯等进入机体后，可引起重要器官病理性损伤几率增加，甚至诱发癌症[3-4]。物理化学特性如颗粒晶体结构、尺寸、化学组成等都可影响NPs毒性，其中，颗粒尺寸是NPs较正常颗粒毒性更大的主要因素，较小的尺寸更易进入并累积到机体深层，影响器官及细胞正常活动，颗粒尺寸减小将引起颗粒表面积增大，同时也增加了活细胞中的化学反应性和颗粒的可穿透性[5-6]。

NPs以吸入(inhalation)、皮肤渗透(dermal penetration)和口服摄入(ingestion)三种最为常见的途径进入人体，随食物或空气吞入的NPs主要在小肠被吸收并进入血液，吸入的NPs聚集到肺，然后进入肺毛细血管[7-8]。之后，NPs通过血液循环分布并积累到全身各个器官，甚至通过血脑屏障、胎盘屏障等，其中，肝脏是NPs体内积累的最主要靶器官[9]。肝脏对人类健康有重要维护作用，是人体最主要的代谢及解毒器官，但是，NPs积累到肝脏后，可引起肝细胞毒性、脂质过氧化反应、慢性炎症等，而慢性肝脏炎症的持续进展和恶性转化可以导致肝癌发生。因此，NPs对肝细胞及肝脏的损伤及毒性研究成为评价纳米颗粒安全性的重点。

1 纳米颗粒对肝脏毒性效应

使用最为广泛的颗粒如纳米银、纳米二氧化钛、纳米氧化铜等是近年来研究NPs对肝脏毒性效应的重点，已有大量研究证实，这些颗粒能产生明显肝脏毒性，引起肝酶升高、肝脏炎症以及肝组织坏死等。

1.1 诱发肝脏炎症

NPs诱发肝脏炎症可能与促炎因子表达升高相关。实验发现，雄性Wistar大鼠以气管滴注的方法每周两次暴露于0.24 mg/kg纳米氧化镍中，持续6周后出现肝脏炎症，进一步分析发现，纳米氧化镍明显增加了肝脏中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的浓度，但降低了抗炎细胞因子IL-4和IL-10的水平[10]。而另一个研究选用直径1 nm和8 nm的纳米铂给小鼠进行静脉注射，发现1 nm的纳米铂在给药后3和6 h均显著诱导了IL-1β和IL-6的产生，肝脏出现炎症，相较而言，8 nm的纳米铂即使在20 mg/kg下也未对小鼠产生明显毒性[11]。

含有NPs的材料也同样可能引起肝脏损伤。Saber等[12]研究证实，给小鼠气管滴注含多壁碳纳米管的环氧树脂复合材料机械磨损产生的粉尘溶液会引起小鼠肝脏炎症和坏死等组织病理学改变，但是暴露在不含多壁碳纳米管的环氧树脂粉尘溶液中的小鼠中未观察到肝脏的损伤。

1.2 引起肝脏损伤

NPs还可引起肝脏损伤。Alarifi等[13]通过腹膜内注射50 nm的纳米二氧化钛后，在小鼠肝脏中观察到肝脏组织学变化以及碱性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)和谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)水平的增加，指示肝功能受损严重。用声辐射力脉冲成像读取肝脏剪切波速(shear wave velocity，SWV)值并检测血清丙氨酸转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)，发现吸入二氧化硅纳米颗粒能增加SWV和ALT值，诱导大鼠肝损伤[14]。雄性Wistar大鼠通过每周气管内滴注纳米氧化镍(0.015、0.06和0.24 mg/kg)两次，结果显示，纳米氧化镍暴露后，ALT、天冬氨酸转氨酶、ALP和γ-谷氨酰转肽酶升高，肝细胞水肿，肝窦消失，嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润，肝脏损伤严重[10]。小鼠暴露于200 mg/kg纳米氧化锌90 d 可造成肝脏损伤，包括局灶性肝细胞坏死、中央静脉充血扩张、ALT和天冬氨酸转氨酶水平显著升高[15]。

1.3 改变肝脏结构及功能

NPs还可引起肝脏结构及功能改变。此外，Sun等[16]将斑马鱼胚胎暴露在50 mg/L的纳米氧化铜下4 h后，发现纳米氧化铜可引起肝毒性，同时斑马鱼胚胎暴露于高剂量的纳米氧化铜中会导致肝脏发育不良。Vesterdal等[17]给Zucker大鼠经口灌胃6.4 mg/kg 的碳黑后，大鼠肝脏的脂质负荷增加，研究认为碳黑暴露与肝脂肪变性有关。Almansour等[18]将雄性Wistar白化大鼠暴露于纳米氧化锌中(每日暴露剂量为2 mg/kg)，持续21 d后取大鼠的肝脏活组织进行组织病理学检查，他们发现，与对照组大鼠相比，暴露于纳米氧化锌的大鼠肝组织中出现窦状扩张、小叶和门静脉三支血管炎性细胞浸润、肝组织坏死、水样变性等。

此外，当机体存在慢性肝病如酒精性肝病、脂肪肝等情况下接触纳米颗粒，更易导致肝脏损伤加剧。有研究用不会引起正常小鼠肝组织毒性的纳米银浓度处理超重小鼠时，纳米银易促使小鼠的脂肪肝发展为脂肪性肝炎，该研究还发现纳米银会进一步抑制脂肪酸氧化，诱导并增加小鼠肝脏炎症[19]。Kermanizadeh等[20]将乙醇预处理小鼠暴露于纳米银后，小鼠的肝脏炎症和肝脏病变程度恶化，另外，该研究还发现乙醇影响了肝脏受NPs攻击后的恢复能力。

2 纳米颗粒毒性效应的可能机制

NPs通过产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)、诱导DNA损伤、损伤细胞膜、改变基因组甲基化等毒性机制，诱导肝脏毒性，对肝细胞及肝脏组织产生损伤，最终影响肝脏正常功能，打破机体健康。其中，研究普遍认为，NPs表现出毒性作用的主要机制是产生过量ROS，最终诱导细胞发生氧化损伤，而近年来研究也发现，除了产生ROS，NPs也可直接破坏细胞膜、扰乱基因表达等引起肝细胞和组织坏死。

2.1 产生ROS

NPs可通过三方面诱导ROS的产生。其一，部分NPs表面如纳米二氧化硅有促氧化功能团，当与胞内氧化剂结合后可直接产生ROS；其二，当NPs进入细胞的线粒体后，它们会损伤电子传递链、引起线粒体膜的去极化，而受损线粒体则会产生大量ROS；其三，NPs进入细胞中会激活包括巨噬细胞和嗜中性粒细胞在内的免疫细胞，活化的免疫细胞则会增加ROS的产生[21]。由NPs诱导的胞内过量 ROS 生成及其引起的胞内氧化应激反应正是导致细胞、组织损伤甚至细胞死亡的主要原因之一。其中，ROS可与DNA发生反应，导致DNA氧化，DNA链断裂，形成DNA损伤的生物标志物即8-氧代-7，8-二氢-2 -脱氧鸟苷 (8-oxo-7，8-dihydro-2 -deoxyguanosine) ，并诱导微核形成，产生明显遗传毒性[22]，也可与脂质发生反应，形成脂质过氧化物，破坏及损伤生物大分子，影响细胞功能。

2.2 损伤细胞膜

NPs可直接(物理损伤)或间接(氧化损伤)破坏细胞膜结构及活性，导致细胞死亡。Salatin等[23]发现，带正电荷的NPs能增加与带负电荷的细胞膜的相互作用，从而增加细胞吞噬作用，破坏细胞膜功能。此外，NPs还可通过产生脂质过氧化来影响细胞膜完整性和功能稳定[24]。

2.3 形成蛋白质电晕

NPs进入生物环境中导致带负电荷的蛋白质吸附在带正电荷的颗粒上，形成蛋白质电晕(protein corona)。蛋白质电晕会改变NPs的尺寸、聚集状态以及表面性质，也会影响细胞对NPs的摄取[25]，此外，胞内蛋白质也因吸附带电纳米颗粒而改变其分子构象及折叠，最终失活。研究发现，吸附在超顺磁性纳米氧化铁上时，转铁蛋白会因构象修饰而失活[26]。另外，纳米二氧化钛对磷酸盐基团具有高度亲和力，它会结合蛋白质的磷酸化形式，干扰涉及磷酸化-去磷酸化反应的细胞过程，比如在细胞信号传导过程中的级联放大反应，有研究猜想这可能是纳米二氧化钛损伤如DNA修复过程等细胞内信号通路的一种方式[27]。

2.4 改变基因组甲基化状态

NPs可通过改变DNA甲基转移酶表达及活性，影响DNA甲基化水平，从而影响全基因组表观遗传修饰，这可能在NPs致癌过程中起重要作用。Mytych等[28]发现纳米金刚石能促使DNA甲基转移酶表达上调，引起癌细胞基因组高甲基化。Bai等[29]研究亦表明，纳米二氧化钛会增加DNA甲基转移酶活性，从而引起DNA修复蛋白启动子甲基化异常。

3 减少纳米颗粒产生肝脏毒性的策略

基于NPs最主要毒性是产生ROS，近来，部分研究也着力于找出可有效代谢、控制ROS的抗氧化剂，以对NPs引起的肝脏毒性起到缓解作用。Niu等[30]发现，葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract，GSPE)可以剂量依赖的方式降低暴露在纳米二氧化钛中小鼠细胞的DNA损伤、ROS生成及丙二醛积累，有效阻止了小鼠暴露于纳米二氧化钛下肝的组织病理学和生物标志物的改变。Azim等[31]发现口服纳米二氧化钛导致MDA水平升高，小鼠肝脏谷胱甘肽表达降低，DNA损伤明显，而在纳米二氧化钛暴露后1个月，肌钛和维生素E的组合口服治疗，可减弱小鼠肝脏的毒性作用。

Sonane等[32]研究发现，纳米二氧化钛和氧化锌可诱导产生ROS并提高秀丽线虫致死率，但姜黄素和维生素C可在纳米颗粒存在的情况下提高线虫生存率，降低ROS的产生。该研究也提出将姜黄素和维生素C并入日常饮食可避免纳米毒性，抗氧化剂的膳食补充在对抗NPs的毒性以及致死性方面非常有效，并可提供机体抵抗进一步暴露的能力。

4 展望

目前，NPs毒性研究已逐渐深入，研究者们试图从不同层面来解析NPs的致毒机制，以便更好对各种纳米材料进行安全性评价。NPs引起的氧化损伤容易导致组织发生炎症，而人类及环境的NPs暴露浓度较低，往往不能在短期出现急性损伤，但容易产生慢性炎症，因此，NPs对肝脏毒性的评估也应把长期低剂量暴露考虑在内。此外，检测、靶向、治疗且不产生副作用的纳米肿瘤学方面的研究也正在兴起，NPs由于尺寸小，可进入到机体任何细胞当中，有研究也发现，纳米银、纳米金及纳米银/金混合物可在二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导的肝癌中起到保肝活性，它们可特异性杀死肝癌细胞，对肝癌有潜在的抗癌活性，但不影响动物的体质量，因此，研究也认为纳米银和纳米金可能具备有效纳米药物开发的潜力[33]。这项研究给我们以启示，如果确定某种NPs可定向损伤某类细胞群体，将会极大推进肿瘤靶向治疗。最后，在日常饮食中使用抗氧化剂作为减缓纳米毒性的方法还需进行大量研究，以便在目前尚不能对NPs进行准确的安全性评价的情况下，我们可通过简单有效的方法避免NPs引起的慢性炎症，降低退行性疾病发生风险。