WFDC1基因在肝癌中的表达及其诊断和预后价值

赵 吉 刘文斌 陈洪强刘晋祎杨惠芳* 曹佳*

（1．宁夏医科大学公共卫生与管理学院，宁夏银川 750004；2．陆军军医大学军事预防医学院毒理学研究所，重庆 400038）

肝癌是最为常见的消化系统恶性肿瘤之一。近年肝癌在全世界癌症的死因中位列第2位，其发病率和死亡率不断升高[1]。而对肝癌的治疗手段主要是肝切除和肝移植[2]，以及一些适当的药物治疗，但只有5%～10%新发肝癌患者可以进行手术切除，而且术后具有较高的复发率[3]。同时很多患者都是在晚期才确诊，这也是导致肝癌患者生存率较低的因素之一。因此，筛选出可以早发现、早诊断、早治疗的生物标志物[4]，可以作为降低肝癌的发生率、死亡率以及改善肝癌病人预后的重要手段，具有十分重要的科学和临床价值。

在前期的筛选实验研究中[5]，我们通过甲基化芯片和表达谱芯片分析发现WFDC1(whey acidic protein four-disulfide core domain 1)基因在肝癌组织中有较高的甲基化水平且表达下调，因此我们推测它可能是一个候选的抑癌基因。WFDC1基因定位于染色体16q24[6]，这是癌症中杂合性频繁丧失的一个区域，它在前列腺癌[7]、 黑色素瘤[8]、 纤维肉瘤[9]等肿瘤中表达均明显下调。目前还未见有关WFDC1基因在肝癌组织中的表达情况及其与患者生存和预后关系的文献报道。为了分析WFDC1基因在肝癌患者中的表达情况，探讨该基因在肝癌患者中的表达是否可以作为肝癌早发现、早诊断、早治疗的生物标志和生存预后的指标，我们采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测了40例肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，以及肝癌细胞株和微囊藻毒素(microcystin-leucine arginine，MCLR)诱导的L02恶性转化细胞中WFDC1 mRNA的表达水平，同时利用肿瘤基因图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库中表达的数据，分析了该基因表达与临床病理指标以及肝癌患者生存预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞株和细胞培养

正常人肝细胞株L02、肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7，均购于中国科学院上海细胞库。肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7用含10%胎牛血清的DMEM培养基在CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。

在L02细胞培养过程中，采用10 μg/L的微囊藻毒素连续染毒培养至35代，分别在第5、15、25、35代收取细胞样品，命名为P5、P15、P25、P35。同时采用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验对不同代数的恶性转化细胞进行了恶性程度的检测[5]。

1.2 临床样本

40例肝癌患者的癌组织和癌旁组织来源于陆军军医大学第一附属医院手术切除的肝癌患者的组织，距离肿瘤边缘5 cm以外的组织作为癌旁对照组，所有肝癌组织和癌旁组织都经过病理验证。取出样本后立即置于液氮中速冻然后置于-80 ℃冰箱保存。所有样本的采集均取得患者知情同意并经过医院伦理委员会批准同意。

1.3 细胞总RNA提取

向细胞培养皿中加入2 mL PBS进行冲洗，然后加入1 mL Trizol，用枪反复吹打。将液体转移到新的1.5 mL EP管中，加入0.4 mL的氯仿，剧烈摇动1 min。室温静置2～3 min后，12 000 r/min、4 ℃离心15 min。然后取上清无色水相到 EP管，加0.5 mL预冷的异丙醇，在 -20 ℃ 放置 2 h。然后 12 000 r/min、 4 ℃ 离 心10 min，弃去上清，75%乙醇1.0 mL洗涤后，12 000 r/min、4 ℃离心5 min。吸干上清。晾干乙醇10 min，加入DEPC处理水20～30 μL混匀，溶解总RNA，测RNA的浓度值。

1.4 组织RNA提取

称取组织样本0.3～0.5 g，放入预冷的研磨器中，加入1～2 mL Trizol充分研磨样品。其余步骤与细胞提取RNA步骤相同。

1.5 mRNA表达分析

1.5.1 引物设计 根据GenBank中的基因序列，用Primer 5.0设计引物，并由上海生工生物公司合成。引物序列如表1。

表1 引物序列与产物长度

1.5.2 RNA逆转录和实时荧光定量PCR采用Promega逆转录试剂盒，步骤参照试剂盒说明书，用3 μg的RNA为模板合成cDNA，用SYBR®P remix E x T aqTMⅡ试剂盒在PCR仪(美国伯乐公司)进行PCR扩增。反应体系为：上下引物各0.5 μL，cDNA为9 μL，Mix为10 μL，总体系20 μL。反应条件：95 ℃、40 s；95 ℃、40s，60℃、40 s，72 ℃、50 s，共45个循环；72 ℃、5 min。为了检测引物的特异性，设定熔解曲线(60～95℃)。每个样本进行3个复孔检测，采用2-△△CT对PCR结果进行相对定量分析。

1.6 TCGA数据库临床样本数据

肝癌患者基因表达和临床资料数据从TCGA数据库获取(http://tcgadata.nci.nih.gov)。肝癌患者WFDC1 基因的表达的数据集ID为LIHC.sampleMap/HiSeqV2_PANCAN，肝癌患者相关临床病理指标的数据集ID为TCGA.LIHC.sampleMap/LIHC_clinicalMatrix。获得具有WFDC1基因表达数据的肝癌患者的肝癌组织331例，并收集临床病理指标(年龄、性别、肿瘤分期、临床分期)和危险因素等资料。在331例肝癌患者中有50例肝癌患者具有肿瘤和癌旁组织配对标本。将数据库中331例肝癌患者WFDC1基因表达数据取中位数，将高于中位数的值定义为高表达，低于中位数的值定义为低表达。

1.7 Kaplan-Meier分析

通过对WFDC1基因表达数据库的整理，我们以WFDC1 mRNA表达的平均值为界限值将肝癌患者划分为低表达与高表达两个组别，用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表达与肝癌患者生存预后之间的关系。通过对TCGA数据库变量的调整[肿瘤(1+2)期和(3+4)期[10]]，然后分别对变量使用Kaplan-Meier法进行生存分析。所有患者结局的标准均以肝癌引起的死亡。

1.8 特异度和灵敏度分析

通过对WFDC1 mRNA表达的数据和临床资料的整理和分析，主要利用肝癌患者和癌旁组织基因表达以及肿瘤分期[(1+2)期和(3+4)期]的数据，用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)模型分析WFDC1基因表达作为肝癌患者临床诊断指标的特异度和灵敏度。

1.9 统计学分析

采用SPSS 19.0对数据统计进行分析。用t检验分析WFDC1基因在肝癌组织与癌旁组织间的表达差异，用方差分析WFDC1基因在恶转细胞中各个代数的表达差异以及在不同肝癌细胞中的表达差异。χ2检验分析WFDC1基因表达与不同临床分期、肿瘤分期的差异以及分析该基因与临床基本病理指标和危险因素之间的相关性。通过ROC曲线模型分析WFDC1基因表达对患者临床诊断的价值。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 WFDC1 mRNA在肝癌细胞和MC-LR诱导的L02恶性转化细胞中的表达水平

我们采用qPCR法检测了在不同肝癌细胞株和MCLR诱导的L02恶性转化细胞中的WFDC1 mRNA表达水平。结果表明，与L02细胞比较，WFDC1 mRNA在SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7等4种肝癌细胞株中均低表达(图1A)。同时随着MC-LR诱导的L02恶性转化细胞代数的不断增加，WFDC1 mRNA的表达逐步下调(图1B)。

图1 WFDC1 mRNA在肝癌细胞株和MC-LR诱导L02恶性转化细胞中的表达水平

2.2 WFDC1 mRNA在肝癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平

qPCR结果表明，在40例肝癌患者中，WFDC1 mRNA在癌组织的表达显著低于癌旁组织 (图2，t=5.624，P＜0.01)。

2.3 TCGA数据库中WFDC1 mRNA在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况

为了进一步验证该基因在临床组织样品的实验结果，我们利用genome-cancer(https://genome-cancer.ucsc.edu)网络分析WFDC1 mRNA在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况，见图3。结果表明，WFDC1 mRNA在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织中的表达(图3B，t=3.551，P＜ 0.01)。在TCGA数据库中的50例肝瘤组织及其配对的50 例癌旁组织中也发现，WFDC1 mRNA的表达在肝瘤组织明显低于癌旁组织。两组之间的差异具有统计学意义(图3C，t=3.990，P＜0.01)，与实验结果基本一致。

图2 WFDC1 mRNA在肝癌患者肿瘤及癌旁组织中的表达水平

2.4 WFDC1 mRNA表达与肝癌患者临床指标和疾病危险因素之间的关系

我们对WFDC1 mRNA的表达情况按不同的临床病理特征和不同的危险因素进行分组分析，以此来确定该基因的表达情况与肝癌患者的危险因素以及临床病理指标之间的关系。结果表明，WFDC1 mRNA的表达在不同肿瘤分期和临床分期中差异有统计学意义(P＜0.05)。但与患者的年龄、性别、是否饮酒、是否有病毒感染(HBV和/或HCV)等危险因素无显著相关性(P＞0.05)(表2)。

图3 TCGA数据库分析WFDC1 mRNA在癌旁组织和肝癌组织中的表达

表2 WFDC1 mRNA表达情况与肝癌临床病理特征和危险因素的关系

2.5 WFDC1 mRNA表达与肝癌患者生存预后之间的关系

我们采用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表达与肝癌患者生存预后的关系。结果表明，WFDC1 mRNA表达与肝癌患者术后的生存时间有显著相关性，WFDC1 mRNA高表达患者的术后生存时间显著高于低表达的患者，差异具有统计学意义(图4A，Logrank=4.80，P＜0.05)。按肿瘤分期进行分类分析发现，在肿瘤(1+2)期中，WFDC1 mRNA高表达患者的术后生存时间显著高于低表达患者(图4B，Log-rank=3.92，P＜0.05)，而在肿瘤(3+4)期的肝癌患者中，低表达患者的术后生存时间与高表达组无显著相关性(图2C，Logrank=0.001，P＞0.05)。

2.6 WFDC1 mRNA表达在肝癌中的诊断价值

为了更加明确WFDC1 mRNA的表达在肝癌诊断中的价值，我们利用ROC模型对该基因表达情况进行了分析。结果表明，WFDC1 mRNA表达在肝癌中具有较好的特异度和灵敏度，ROC曲线下面积AUC= 0.829，95%CI为0.788～0.871(图5A)。而在肿瘤(1+2)期，ROC曲线面积AUC=0.834，95%CI为0.789～0.879 (图5B)。在肿 瘤 (3+4)期 ， ROC曲 线 面 积 AUC=0.832， 95%CI为0.765～0.899(图5C)。提示该基因是一个潜在的诊断标志物。

图4 肝癌患者WFDC1 mRNA表达的Kaplan-Meier生存曲线

图5 WFDC1 mRNA表达在肝癌诊断中的ROC曲线

3 讨论

WFDC1蛋白含有220个氨基酸，包括了23个酸性氨基酸、30个碱性氨基酸、48个极性以及65个疏水氨基酸，同时大鼠和人的WFDC1基因均含7个外显子，并且在外显子2上几乎包括了同样的乳清酸序列[11]。WFDC1蛋白也是乳清酸蛋白家族的一员，这个家族的特点就是至少含有一个由50个氨基酸组成的乳清酸蛋白的序列，其中就包含了由8个氨基酸高度保守的半胱氨酸残基所形成的4个二硫键[12]。WFDC1基因定位于16q24染色体，这是癌症中杂合性频繁丧失的一个领域，该基因可能有抑癌因子的功能[13]。WFDC1基因与多种恶性肿瘤的发生发展都有联系，包括前列腺癌[14]、 乳腺癌[15]、 肝细胞癌[16]、 黑色素瘤等[8]，并且可能参与抑制细胞增殖。编码的蛋白质也可能在某些CD4记忆T细胞对人类免疫缺陷病毒感染的易感性中起作用[17]。PS20通过调节细胞间缀合物的形成而成为HIV-1易感染的CD4+T细胞的新型标志物[18]。目前WFDC1基因与肝癌的发生和机制方面的研究比较少，尤其与临床生存预后的研究目前还未见报道。

在本研究中我们发现，与癌旁组织相比，该基表达因在癌组织中显著下调。同时在不同的肝癌细胞株以及MC-LR诱导的恶性转化细胞中证实WFDC1 mRNA表达显著下调，由于随着MC诱导的恶转细胞代数的增加，该基因的表达也逐步下调，提示该基因参与了肝癌的发生发展过程。通过对TCGA数据库的大样本数据分析，也证实该基因在肿瘤组织的表达低于癌旁组织，提示WFDC1可能在肝癌发生过程中发挥抑癌作用，有必要进一步开展系统的实验研究。

WFDC1 mRNA在肝癌患者生存预后的分析中表明，WFDC1 mRNA的表达与肿瘤分期以及临床分期有显著相关性，该基因高表达患者的术后生存时间明显高于低表达患者。而与患者的年龄、性别、是否饮酒、是否有病毒感染等危险因素无显著相关性。这提示我们WFDC1 mRNA的表达与肿瘤分期有着密切的联系，有可能对肝癌患者生存预后的判断有一定的诊断价值。ROC模型分析表明WFDC1 mRNA的表达水平在肝癌患者的诊断中具有较高的特异度和灵敏度(AUC=0.829， 95%CI为 0.788～0.871)， 这 提 示 我 们 WFDC1 mRNA的表达可用于肝癌的初步诊断。由于目前我们只是在肝癌细胞株和临床组织标本中做了部分验证实验以及用TCGA数据库表达的数据去分析，所以对于该基因作为分子诊断的生物标志物还需要更多的临床标本去验证，而具体的功能还需要更大的样本去进行研究。

综上所述，WFDC1基因在肝癌中的表达与肿瘤的发生发展以及与肝癌患者的生存预后有密切相关性，是一个重要的候选生物标志物。同时WFDC1基因在肝癌中可能是一个潜在的抑癌基因，有必要进一步去研究该基因在肝癌中的机制及功能，为全面掌握WFDC1基因在肿瘤中的作用奠定基础。