华蟾素对骨癌痛大鼠的镇痛效应及对脊髓胶质细胞活化的影响

刘 丹 ，张 文，王心怡，陈 涛 ，胡 卫*

（三峡大学医学院国家中医药管理局中药药理/肿瘤科研三级实验室，湖北 宜 昌 443002）

骨癌痛(cancer-induced bone pain，CIBP)是一种特殊的慢性疼痛且随着疾病的进展不断增加，其产生是由原发性肿瘤细胞转移至骨所致[1]。发生骨转移的患者通常起初无明显症状，直到出现骨的疼痛或者骨骼相关并发症(如骨质破坏等)时才能被明确诊断，而在转移晚期，这种疼痛很难治疗，严重影响患者的生活质量[2]。因此，我们仍需进一步探索CIBP发生发展的机制，寻求新的止痛剂及治疗方案。

中医药治疗CIBP有肯定的疗效，以其升高痛阈，降低机体对不良刺激反应程度，改变精神状态来减轻痛苦，且使用安全、无成瘾性和戒断性，目前已经广泛应用于CIBP的各个阶段[3]。其中，我国传统的名贵药材——蟾蜍，具有解毒、消肿、止痛、抗炎抗肿瘤等功效，在临床上应用非常广泛，其全皮水提物华蟾素是我国自行研制的二类新药[4]。课题组前期研究发现华蟾素可通过阿片受体与阿片肽结合后抑制神经递质P物质(substance P，SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的表达，减少疼痛的传递抑制癌痛的发生和发展[5]。另有研究发现华蟾素能使炎性疼痛模型大鼠的炎症和疼痛明显缓解且呈现一定的剂量依赖性，抑制炎症介质的释放发挥其抗炎镇痛作用可能是其镇痛的机制之一[6]。基于此，本实验将进一步探讨华蟾素是否能通过抑制CIBP大鼠脊髓胶质细胞的活化减少炎性介质释放而发挥抗炎镇痛作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

实验造模开始前进行大鼠机械痛与热痛阈值的检测，根据前期实验及文献核实，确定正常大鼠机械痛阈值范围为26.0～32.0 g、热痛阈值范围14.0～19.2 s，根据这个范围进行实验大鼠筛选。测量的起始值都是从0开始，筛出SPF级雌性(本实验选用的骨癌痛造模细胞是乳腺癌细胞，在雌性大鼠体内传代，选用雌性大鼠造模更合理)SD大鼠48只，体质量160～180 g，由三峡大学医学院实验动物中心提供[实验动物许可证号：SCXK(鄂)2011-0012]。将大鼠随机分为4组，正常对照组、假手术组、模型组和华蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司，国药准字Z34020274，规格为每支5 mL，货号150723-25)干预组，每组12只，华蟾素干预组于造模第7天开始腹腔注射华蟾素注射液(5 mL/kg，每天1次，连续8 d)，其余各组每天予以等量生理盐水。

1.2 骨癌痛模型制备

取雌性幼鼠2只，体质量60～80 g，腹腔注射乳腺癌Walker 256细胞0.5 mL(细胞浓度为4×107/mL)，接种第7天收集腹水，以无菌PBS(0.01 mol/L)漂洗细胞3次，细胞浓度调整至4×105/mL的浓度，置于冰上备用。模型组与华蟾素干预组大鼠麻醉后，仰卧固定于大鼠操作台，备皮后碘伏消毒右侧后肢胫骨处皮肤，于胫骨上段作l cm切口，暴露胫骨，在胫骨结节下0.5～l cm胫骨平台上用1 mL注射器针头垂直钻孔至骨髓腔，待骨髓血液无明显外流后，再用微量注射器将Walker 256细胞悬液0.01 mL缓慢注入骨髓腔，注射完毕后用医用无菌骨蜡封住针孔，常规消毒伤口，局部给予少许青霉素后缝合伤口。假手术组操作与上述相同，用微量注射器注射0.01 mL PBS。

1.3 大鼠行为学检测

分别于造模前、造模后第2、5、7、9、13、15天进行相关行为学(热痛、机械痛)检测。将大鼠置于底为网格的特制有机玻璃内，待大鼠安静后，将von Frey 2391 探针分别刺激大鼠左右后足脚掌中部皮肤测定机械痛值，观察大鼠缩足反应并记录大鼠的机械性阈值；大鼠置于底为光滑玻璃的有机玻璃格子内，适应一段时间后采用辐射热测痛仪测热痛值，将强热光束分别照射大鼠左右后足脚掌中心皮肤，引起大鼠缩爪反应时间为大鼠缩爪潜伏期，实验光源强度设定为35%，为防止大鼠烫伤，将上限值定为20 s。每只大鼠每个行为学测定3次，前后两次间隔10 min，取平均值。

1.4 X-ray评估骨质的破坏

在大鼠胫骨接种肿瘤细胞后，为了确定肿瘤生长对骨质的破坏，在造模后第7天将大鼠接种侧和对照侧后肢放在X光胶片(柯达公司，货号XBT-1) 前，暴露在30 kVp强度的X射线下1 min，X光片在显影剂(天津市汉中摄影材料厂，KonicaSRX-101)下显影，进行X线检测。

1.5 免疫组化检测胶质细胞活化情况

实验终末，大鼠麻醉后用多聚甲醛常规灌注固定，取L4～L6段脊髓，30%蔗糖脱水后，冰冻冠状切片，收集切片于0.01 mol/L PBS中，每个脊髓标本分别选择5张切片与小鼠胶质纤维酸性蛋白(glial filament acidic protein，GFAP)抗体(Abcam公司，1∶100稀释)和兔小胶质细胞标记小钙结合蛋白—钙离子结合分子(ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba-1)抗体(Abcam公司，1∶100稀释)于4 ℃孵育12 h；依次加入生物素标记的二抗(HRP标记山羊抗兔/小鼠二抗)、亲和素-生物素-过氧化物酶孵育后，以3，3´-二氨基联苯胺(DAB)呈色。显色完成后将切片置于载玻片上，常规乙醇脱水，二甲苯透明，明胶封片，于光学显微镜下检测胶质细胞的活化状态。

1.6 酶联免疫吸附试验检测相关炎性因子表达情况

实验结束时麻醉大鼠，切开腹部，剥离腹主动脉，采血针取血4～5 mL，静置2 h后离心，取血清；冰上取出L4～L6段脊髓，匀浆后离心取上清液。按酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明进行相关炎性因子(TNF-α和IL-1β)的检测。

1.7 统计学处理

运用SPSS 19.0软件包进行统计分析处理。采用方差分析进行数据检验(有重复测量资料方差分析、单因素方差分析)，两组间的两两比较，方差齐时用LSD法；方差不齐时，用Dunnett T3法。

2 结果

2.1 大鼠胫骨的影像学变化

大鼠胫骨X-ray结果显示，在造模后第7天，正常对照组大鼠的骨质完整，骨皮质呈连续状，边界光滑、清晰，骨髓腔内未见明显异常(如图1A)；假手术组骨质些许缺损，骨皮质呈连续状，周围骨组织未见明显肿胀(如图1B)；模型组大鼠明显的骨质破坏，同时骨皮质有明显的缺损，骨内结构不清晰，周围骨组织明显肿胀(如图1C)。说明骨癌痛大鼠造模成功。

图1 大鼠胫骨的影像学变化

2.2 华蟾素对骨癌痛大鼠行为学的影响

大鼠行为学检测结果显示，与正常对照组比较，假手术组大鼠热痛阈值、机械痛阈值均无明显变化，模型组大鼠的热痛阈值与机械痛阈值均明显降低，差异均具有显著的统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，华蟾素干预后可显著上调大鼠热痛阈与机械痛阈值，差异均具有显著的统计学意义(P＜0.01)，结果见图2。

2.3 华蟾素对骨癌痛大鼠脊髓胶质细胞活化的影响

大鼠免疫组化结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓星形胶质细胞标记蛋白(GFAP)和小胶质细胞标记蛋白(Iba-1)含量均明显增加，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)；与模型组相比，华蟾素干预组大鼠脊髓GFAP和Iba-1蛋白表达均降低，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)，结果见图3。

2.4 华蟾素对骨癌痛大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表达的影响

ELISA检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表达均明显上调，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)；与模型组相比，华蟾素干预组大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β浓度均降低，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)，结果见图4。

图2 华蟾素对骨癌痛大鼠行为学的影响

图3 华蟾素对骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞标记蛋白GFAP和小胶质细胞标记蛋白Iba-1表达的影响(×400)

图4 华蟾素对骨癌痛大鼠脊髓及血清中相关炎性因子表达的影响

3 讨论

CIBP是一种特殊的疼痛，与一般疼痛相似但又有其独特的特征，主要包括肿瘤的生长破坏骨组织引起的机能减弱，此外，其同时包含炎性疼痛及神经病理性疼痛两方面，被认为是治疗最困难的疼痛之一，严重影响患者生活质量[7-8]。越来越多的研究发现中枢神经系统中的一些免疫功能细胞(主要是星形胶质细胞和小胶质细胞)在慢性疼痛形成的病理机制中占有重要地位[9-10]。在CIBP中，可以发现脊髓星形胶质细胞与小胶质细胞的激活，激活的胶质细胞主要是特定胶质细胞标记物的上调或形态的改变，包括肥大、增生等。小胶质细胞被激活后，Iba-1表达上调[11]；激活的星形胶质细胞会发生形态的改变(如细胞肥厚)、GFAP表达的增加，引起转录后的修饰，导致脊髓促炎物质，包括TNF-α、IL-1β、ROS、兴奋性氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)，增加神经的兴奋性，加重疼痛反应[12-13]。而在CIBP大鼠中予以胶质细胞抑制剂，可有效降低一些细胞因子(TNF-α、IL-1β等)的表达，减轻大鼠的机械痛和热痛，可以缓解或阻断疼痛的发生和发展[14]。

华蟾素及其原药材蟾蜍皮具有解毒散结、消肿止痛的功效，亦有文献记载其具有扶正补虚，强心定痛之功效。对于癌痛“邪毒於结、本虚标实”的病机特点，华蟾素既能清热解毒、消肿散结以治其实，又能扶正以治其虚，因此控制癌痛方面表现出较好的疗效。CIBP发病机制不同于单纯的神经病理性疼痛或炎性痛，它是神经病理变化、炎性反应和组织坏死等因素的综合结果，从功效上分析，华蟾素能治疗CIBP一方面是因为其能清热解毒以消炎止痛，另一方面与其消肿散结以控制肿瘤生长、减轻肿瘤周围组织的肿胀压迫而缓解神经病理性疼痛有关。本课题组前期研究发现华蟾素能增加背根神经节阿片受体表达发挥外周镇痛，但其如何发挥消炎止痛的机制尚不清楚。为了进一步探讨华蟾素抗炎镇痛的机制，本实验通过大鼠胫骨注射Walker 256细胞建立CIBP模型，造模后第7天胫骨X线显示：模型组大鼠骨皮质破坏明显、骨质连续性缺乏、骨组织肿胀明显，对照组、假手术组未见明显骨组织肿胀、骨连续性较好，说明CIBP模型成功。行为学检测结果表明华蟾素可明显缓解CIBP所诱发的机械痛敏、热痛敏，而后的实验结果发现，华蟾素可抑制CIBP大鼠脊髓星形胶质细胞、小胶质细胞的活化，减少脊髓胶质细胞相关炎性介质(TNF-α和IL-1β)的释放，同时也可降低其释放到血清中的TNF-α和IL-1β浓度。这些结果表明华蟾素对CIBP大鼠有较好的镇痛效应，其机制之一可能是通过抑制脊髓星形胶质细胞及小胶质细胞活化、减轻炎症反应发挥作用的。